王松雪:国内外真菌毒素检测标准制修订现状与进展

  • 时间:2016-12-11

王松雪 鲁沙沙 张艳 谢刚 王海鸥

真菌毒素对农业、畜牧业及人们身体健康的严重危害,促使世界各国对真菌毒素的污染问题日益关注和重视。目前至少有100个国家已经对粮食/饲料中真菌毒素的限量进行了规定。我国在2005年公布的强制性粮食卫生标准(GB27152005)中也首次增加了真菌毒素限量的指标,其中包括了四种真菌毒素(黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)),饲料中也已经分别规定了赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇以及T2毒素的限量标准(GB 13078.22006饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量,GB 13078.32007配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的允许量,GB 216932008配合饲料中T2毒素的允许量)。其它如“粮食中T2毒素的限量标准”、“粮油食品中赭曲霉毒素A的限量标准”等也正在制定中。世界各国对真菌毒素限量的强制性规定进一步推动了真菌毒素检测方法的发展。目前真菌毒素的检测方法发展很快,已经从传统上以薄层色谱法(TLC)为主,发展到目前以现代色谱、色质联用法和免疫分析方法为主,各种技术并存发展的局面。高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和各种质谱联用技术如气质联用(GCMS)、液质联用(HPLCMS)以及基于免疫化学基础上的免疫分析方法如酶联免疫吸附法(ELISA)等现代技术得到了广泛的应用。以高新为特点的相关现代色谱技术前处理产品如固相萃取柱(SPE)、免疫亲和柱(IAC)、多功能柱(MFC)等也在各种检测中得到了广泛应用。在技术发展的基础上,以国际标准化组织(ISO)、国际分析化学师协会(AOAC)、欧盟标准组织(CEN)和我国国家标准(GB)等为代表的一些标准组织和机构相继制定了常见几种真菌毒素检测的方法标准,这些标准的制定和实施基本反映了当前国际上真菌毒素检测方法标准的现状和技术应用水平,为国内外食品安全提供了强大的技术支撑和重要保障。国际上普遍关注的真菌毒素主要有黄曲霉毒素(AFLsB1B2G1G2M1M2)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、伏马毒素(FB1FB2FB3)T2毒素等,本文主要综述了上述真菌毒素的国内外标准方法制修订现状与进展。

1 当前国内外一些标准机构和组织制定的真菌毒素检测标准

1.1 ISO标准体系中的真菌毒素检测方法标准

国际标准化组织(ISO)是世界上最大、最有权威性的国际标准化专门机构。但目前该组织的标准体系在真菌毒素检测方面,涉及有限,仅黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮有相应的检测方法标准,尚没有检索到脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素和T2毒素的检测方法标准(见表1)

其中,涉及到黄曲霉毒素的检测标准是最多的,这也反映了黄曲霉毒素作为世界上发现最早、危害最严重的头号污染真菌毒素,一直得到了国际社会的高度重视。

在所提供的7个黄曲霉毒素检测标准中,分别规定了谷物及其制品、饲料以及牛奶和奶粉中黄曲霉毒素的检测程序,共包括了5种黄曲霉毒素种类,即B1B2G1G2M1,其中M1主要针对牛奶和奶粉,其它种类的检测主要针对谷物及其制品以及动物饲料。在制定年限上,除ISO 14718:19981998年颁发外,其他均在20012007年期间制定颁布实施。在检测技术方面,所提供的7种方法中,有4个采用了现代色谱技术HPLC方法,1个采用了基于现代免疫技术的ELISA方法。其它2个使用的是传统的TLC方法,其中1个针对牛奶和奶粉中AFM1TLC检测方法中引入了高效的IAC现代净化技术,使对AFM1检出限达到2ng。在采用现代色谱技术HPLC的方法中,有2个在前处理阶段引入了现代IAC净化技术,该技术基于抗原抗体反应,对样品中的目标物具有高度的选择性,不仅净化效果理想,而且大大提高了操作的简易性和方便性。

该标准体系中共提供赭曲霉毒素A检测方法2个,为1998年版本,适用于谷物及其制品,均为HPLC方法,在样品的前处理阶段,分别采用了SPE(固相萃取)净化方法和传统的LLP(液液分配)净化方法;玉米赤霉烯酮检测标准2个,早期给出的标准采用的是传统的TLC方法(1985年制定,在2002得到进一步修订)2008年颁布了HPLC方法,在前处理方法中使用了先进的IAC(免疫亲和柱)净化技术,适用对象包括动物饲料及原料。

总体上,ISO标准体系在真菌毒素检测方法尚不完善,一些毒素没有给出相应的检测方法标准,标准中高新技术应用方面也存在一定的滞后。

1.2 AOAC标准体系中的真菌毒素检测方法标准

作为国际上普遍认可的分析检测“金标准”的验证者、颁布者,AOAC(国际分析化学师协会)标准组织在制定真菌毒素检测方法标准方面做了大量的工作,如仅食品中黄曲霉毒素的检测标准方面就有34个,提供检测方法35个。涉及到的黄曲霉毒素种类有B1B2G1G2M1M2,适用包括谷物油料及其制品、饲料、牛奶以及蛋禽类和动物制品等,涉及范围相比ISO更广。在提供的检测方法中,TLC方法17个,ELISA方法5个,微柱法2个,HPLC方法11(包括一个多毒素检测方法)2000年以前,特别是7080年代,制定颁布的标准方法主要是TLC方法,90年代后ELISA方法开始在AOAC标准出现并得到快速发展,该方法通常标明用于快速筛查用途,90年代到最近,HPLC方法标准中一些先进的样品前处理技术得到了应用,特别是IAC技术;AOAC目前提供的HPLC检测黄曲霉毒素的方法标准中,其中采用常规SPE方法3个,采用多功能柱净化方法的1个,而采用IAC的净化方法的有7个。

AOAC目前共提供赭曲霉毒素A检测标准8个,其中TLC 2个,HPLC 6个[包括5IAC净化技术(2000年后)1SPE净化技术];提供玉米赤霉烯酮(ZEN)检测标准3个,其中TLC 1个,HPLC 1个,ELISA 1个。采用IAC技术的HPLC方法还没有制定出,但在其期刊杂志上J.AOAC.INT已经连续发表2;提供脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)检测标准2个,其中TLC 1个,GCECD(气相色谱-电子捕获检测联用)1;提供伏马毒素检测标准3个,其中ELISA 1个,HPLC 2(见表2)

总体上,AOAC的标准体系中,真菌毒素的检测方法已经相对比较完善,在检测对象、检测种类以及新老技术应用等方面覆盖较广,充分体现了随着技术的进步,方法标准得到不断改进和更新,较好反映了技术发展在真菌毒素方法标准建立中的推动作用。

1.3 欧盟标准委员会(CEN)标准体系中的真菌毒素检测方法标准

欧盟标准委员会(CEN)在黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素的检测上都给出了方法标准。其中黄曲霉毒素检测标准5(3个采用的是ISO标准)、赭曲霉毒素A检测标准4个、玉米赤霉烯酮检测标准1个、脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测标准1个、伏马毒素检测标准2个,这些标准大多是在近几年制定的,多数采用的是IACHPLC检测方法,而正在批准或者正在制定的真菌毒素标准中也都是采用的IAC净化技术,如FprEN 15851FprEN 15835FprEN 15829prEN 16007FprEN 15850prEN 15891CEN/TC 275/WG 5N 467prEN 16006。但目前,CEN还没有制定出T2毒素的检测标准(见表3)

总体上,欧盟在高新技术在真菌毒素检测标准中的应用方法走在了世界的前列,充分使用了现有的高新成熟的检测技术。这也和欧盟一贯在食品安全领域的高度重视和严格要求相适应。

1.4 我国国家标准(GB)体系中的真菌毒素检测方法标准

我国目前的国家标准体系中,在食品安全受到广泛关注以及国标委的高度重视下,真菌毒素的检测标准体系已经相对比较完善,当前关注的六类真菌毒素基本上都有了标准检测方法,采用的技术从传统的TLC到基于免疫层析柱净化的高效液相色谱法都有提供,在高新技术在标准的应用推广方面处于国际先进水平。如目前国家标准体系中有关黄曲霉毒素(B1B2G1G2M1M2)的检测标准有8(20034个,20061个,20083),共提供检测方法13个,其中TLC 4个,ELSIA 2HPLC 4个,FLD 2个,微柱法1;有关赭曲霉毒素A(OTA)的检测标准方法有3(20031个、20041个、20091)共提供检测方法4个,其中TLC 2个,ELSA 1个,HPLC 1;有关玉米赤霉烯酮及衍生物等的检测标准方法有7(20041个,20061个,20084个,20091),共提供检测方法8个,其中TLC 1个,ELSIA 1个,HPLC 2(前处理采用IAC净化)HPLCMS 4;有关呕吐毒素(DON)检测标准的方法有3(20031个,20051个,20091),共提供检测方法4个,其中TLC 2个,ELISA 1个,HPLC 1(前处理采用IAC净化);有关T2毒素检测标准的方法有3(20051个,20081个,20091)共提供检测方法5个,其中TLC 1个,HPLC 2(前处理均采用IAC净化)ELISA 2;由国家粮食局科学研究院制定的采用免疫亲和层析净化高效液相色谱法检测粮谷中伏马毒素的国家标准(IACOPAHPLCFLD)目前已经完成报批,正在批准中。此外,200912月由国标委刚刚下达的“关于下达2009年第二批国家标准制修订计划的通知”中(国标委综合[200993),公布了即将制定的5项饲料国家标准中(饲料中T2毒素、黄曲霉毒素总量、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的测定),这些标准全部采用免疫亲和柱-高效液相色谱法,将进一步提高我国国家真菌毒素检测标准体系中的高新技术应用水平,使其在标准的先进性方面处于国际先进水平(见表4)

2 总结和展望

综上,目前国内外真菌毒素检测方法标准呈现出传统和革新技术并存的局面,各种技术基本上都在方法标准中得到了一定程度的体现。薄层色谱方法作为最早发展起来的真菌毒素检测方法依然发挥着重要的作用,在国际标准体系中得到充分的体现,并随着技术进步的不断发展和革新,如ISO 14674: 2005,该标准方法将免疫亲和技术和传统的薄层方法相结合,大大改善了常规薄层色谱法在灵敏度和重复性方面的不足,且保持薄层色谱法简便、快速和样品容量大的特点。色谱技术,特别是高效液相色谱在最近的国际标准体系中已经处于绝对的主导地位,作为定量的检测方法,在国内外实验室和检测机构得到普遍的使用。同时随着免疫技术发展,目前其已经在真菌毒素标准分析体系中得到广泛应用,尤其是ELISA快速筛查方法。在样品的前处理方面,代表着先进技术水平的固相萃取和免疫层析逐渐取代传统的液液萃取方法,特别是基于免疫层析技术的免疫亲和柱,已经成为发达国家和国际组织如欧盟主要采用的标准前处理方法。但是,作为多毒素同时检测的主要技术手段-质谱技术目前在国内外真菌毒素检测方法标准中应用尚少,我国已经制定了一些,如GB/T 219822008GB/T 229632008GB/T 229922008,这些主要是针对动物源性食品中真菌毒素代谢物方面,相信在不久的将来会涌现出更多的基于质谱技术的适用于各种基质的多种真菌毒素,包括其代谢物的检测方法标准。

3 我国真菌毒素检测中存在的问题

同时我们也注意到,由于我国在检测技术研究方面投入相对较少、原创技术方面水平比较落后,虽然近年来在国标委要求积极采用国际标准和国外先进技术,积极和国际接轨的大背景下,我国的真菌毒素检测国家标准制修订方面得到了迅猛的发展,在高技术在标准中的应用推广方面,已经基本上和国际接轨,甚至某些领域还处于先进地位。但总体上,自主创新的技术仍然比较落后,大型精密分析仪器普及使用率仍然较低,特别是分析检测用配套耗材的商品化、国产化发展缓慢,亟待大力支持和发展。

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