孙长坡 代岩石 王松雪 张艳

真菌毒素(mycotoxin)是霉菌产生的一类次级代谢化合物，全世界每年约有25% 的谷物由于真菌毒素的污染而影响食用。霉菌滋生不仅消耗饲料中的营养物质，使饲料质量和饲料报酬降低，而且会引起一系列的临床症状，严重的可造成死亡。因此自1961年英国科学家分离到了第一种真菌毒素--黄曲霉毒素以来，真菌毒素危害所造成的损失已引起人们的高度重视。我国也对粮食及其制品中主要真菌毒素的限量制定了国家标准，从而保护人民的身心健康。当前人们主要通过低水分、低温等技术处理粮食及其制品来防止霉菌生长，并通过物理、化学的方法消减真菌毒素含量。但是这些方法具有破坏营养、去毒不彻底和成本高等缺陷，从而造成实际防控、脱毒效果不理想。

利用生物技术防控、消减真菌毒素不仅不破坏食物的营养成分，而且还可以改善营养结构而增加回报率。当前相关的研究主要集中于筛选、利用拮抗微生物、植物产生的抑菌物质防控粮食及其制品霉变；筛选、克隆对真菌毒素有专一降解作用的生物活性酶进行脱毒；以及采用生物技术培育抗真菌毒素的优良农作物品种。随着产毒真菌基因组测序的完成和基因组学、蛋白组学和代谢组学等新技术的出现，利用生物技术消减、防控真菌毒素的研究迎来了前所未有的发展机遇。

1 真菌毒素的微生物降解

自然界中微生物资源极其丰富，许多种类微生物具有将真菌毒素转变为无毒或低毒物质的降解能力。已经报道有乳酸菌、葡萄梨头菌、无根根霉、米根霉、黑曲霉、亮菌、灰蓝毛菌、红色棒状杆菌、橙色黄杆菌、德氏根瘤菌和枯草杆菌等。利用微生物脱毒条件相对温和，不但不破坏产品品质，而且还会增加产品的营养价值，更利于吸收，因此日益受到广泛关注。

研究发现，将从巨大曲霉菌中克隆的编码抗真菌蛋白AFP的基因与病原菌(稻瘟病菌)中诱导表达型启动子zmpR4相连，构建成的转基因稻谷在稻瘟病菌浸染稻谷时表现出很好的抗病性。变色栓菌(Trametes versicolor)则可以产生一类抑制寄生曲霉产毒的物质可以延迟、抑制毒素合成相关基因的转录使产毒量下降40%～90%，并可有效地防治玉米、小麦的霉变。弯曲乳酸杆菌是对黄曲霉菌、禾谷镰刀菌具有严重抑制作用的一类细菌，也有一定的开发应用前景。但利用乳酸菌发酵去除毒素仅适用于轻度发霉的饲料；处理后的饲料禁止作为主要饲料喂用。Gratz S等研究发现鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)可以减少黄曲霉毒素AFB1在肠道上皮细胞中的转运、代谢，从而减少黄曲霉毒素的毒性。进一步研究发现是由于减少了毒素的跨膜运输和对细胞DNA的损伤而使毒性降低的。橙色黄杆菌(Flavobbacterium auraantlacum)也具有较强的去除黄曲霉毒素的能力，可以去除被黄曲霉污染的食品中的全部毒素，且不会产生新的有毒物质。假丝酵母菌在20d内可以降解80%的黄曲霉毒素AFB1；红色棒杆菌在液体中培养4d后，可以使加入的黄曲霉毒素AFB1几乎全部降解。

微生物对真菌毒素的降解机制主要是将真菌毒素作为营养来源进行了吸收、转化，从而达到降解毒素的目的，在降解过程中，可能相关的代谢酶系参与了反应，因此研究利用相关的降解酶具有很好的前景。

2 真菌毒素降解酶的筛选和应用

采用具有生物活性的酶制剂来降解霉菌毒素是一项新的技术，国内外都进行了大量的探索研究。黄曲霉毒素毒性最强，造成的危害最为严重，所以研究、开发该毒素的降解酶具有潜在的研究价值和经济效益。Liu等研究发现利用亮菌(又名假蜜环菌，Armillariella tabescens)产生的多酶体系(multi-enzyme)可完全降解浓度为16μmol/L的AFB1组分，最终研究发现起作用的是一个起水解作用的蛋白酶。在温和的作用条件下该酶可以作用AFB1，破坏毒性结构双呋喃环，使其开环而起到脱毒的目的(图1)。

经美国马萨诸塞州大学和中国军事医学科学院生物医学分析中心证实该酶是一种新的蛋白质酶。现已利用分子生物学技术获得了编码该酶基因的全长核苷酸序列，并将该基因转入酵母中构建了酵母基因工程菌。该酶未来应用领域广泛，可用于饲料和食品脱毒添加剂、药用酶制剂，以及农作物转基因改造，也可利用该酶开发相关的黄曲霉毒素检测生物传感器，这不仅可产生良好的经济、社会效益,并有助于人类健康。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol DON)也是毒性较强的真菌毒素之一，国内将德国研究、生产的新型微生物去毒剂BH加入到含有DON的霉变小麦中，用仔猪和生长猪分别做动物试验测定了其脱毒效果。结果表明仔猪和成猪均显著增重，并且对生长猪增重的效果好于仔猪。其原因是由于微生物制剂BH在动物体内可减弱DON的毒性作用，从而降低了DON对猪生长的危害。BH作为一种厌氧细菌去毒制剂，其去毒机理尚不清楚，可能是所含细菌在代谢过程中可降解毒素。

研究表明，一些可以产生单加氧酶、内脂酶的特殊微生物对黄曲霉毒素、T-2毒素、呕吐霉素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素等的降解效果非常好，而且可以提高动物的免疫机能和健康水平。其降解机制是内酯酶可断裂玉米赤霉烯酮的内酯环，而单加氧化物酶能氧化降解单孢霉毒素的12、13位的环氧结构。通过分裂霉菌毒素的功能原子团，使之降解成非毒性代谢物，经消化系统排出，不会引起任何副作用。国外从黑曲霉中分离获得一个可以水解赭曲霉毒素的蛋白酶，该酶的活力为36U/mg，最适反应条件是37℃和pH 7.5。其降解赭曲霉毒素的原理是破坏毒素的结构(图2)。

1997年7月Fuchs等从牛的瘤胃内容物中分离到的一株细菌BBSH 797，它具有降解单端孢菌霉烯族毒素的能力。主要是由于BBSH 797菌株产生的酶对单端孢菌霉烯族毒素的12，13-环氧基进行选择性断裂，以达到消除其毒力的作用。其活菌制剂现已被商品化应用，并在畜牧生产中起到了积极的作用。

利用微生物酶的降解作用，并结合生物型吸附剂的吸附作用可使毒素在肠绒毛吸收之前在胃内快速转变成无毒或低毒化合物，而且不影响饲料中营养成分的吸收，是解决饲料中霉菌毒素发生危害的理想方法，也是清除饲料中霉菌毒素的发展方向。但相对于吸附法消减而言，利用微生物、酶以及酵母菌的生物降解法成本较高，其实际应用的价值可能会有所限制，因此将吸附法与生物降解法有机地结合可为霉菌毒素的脱毒带来新的突破。

3 植物源拮抗产毒真菌的物质

植物为了防止有害微生物的侵袭，常可以产生多种抑菌物质，这些抑菌物质可以作为实际应用的防霉剂开发。Mohanlall V等从柑橘中提取的一类含甲氧基的香豆素，该结构与黄曲霉毒素结构类似，在施用过程中，可以诱导植物产生抗性，从而抑制植物生长和毒素的产生。研究发现在农业上常用的除草剂草胺磷浓度为2～2000μg/mL时，可以显著抑制黄曲霉的生长和黄曲霉毒素的产生。但植物源抑菌、降解毒素成分的发现和应用在毒素降解方面并不多，还有待于进一步研究、开发。

4 真菌毒素产生的早期防治

生物之间常常存在相互竞争抑制作用，利用这一原理也可以作为防治产毒真菌的策略之一。2007年5月16日，美国环保署批准了每季玉米抽穗时，可在空气中施用不产生毒素的黄曲霉NRRL 21882(Aspergillus flavus NRRL 21882)，以减少黄曲毒素(aflatoxin)。这不但在田间减少了产毒黄曲霉菌的生长和毒素的产生，而且还可以在粮食储存过程中起到预防作用。近几年还不断有相关的研究报道。

Penna等从不同的生物环境中分离出了多株克鲁维酵母菌(Kluyveromyces spp.)，研究发现大多数菌株在为0.937和0.999等高水活度和20～30e条件下，可以对黄曲霉等菌株的抑制率达到75%～100%。另外，Kimura Norio等发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis NK-330和NK-C-3)制剂早在1988年就被批准用来防治黄曲霉和寄生曲霉的生长和毒素的产生(专利号为4931398)。

曲霉菌首先浸染玉米种子的胚乳，并且产生的大量α-淀粉酶(α-amylase)可以促进毒素的产生。Young等从lablab purpureus中克隆得到编码抑制曲霉淀粉酶活性的AILP(α-amylase inhibitor from　Lablab purpureus)蛋白的labAI基因。所以通过AILP蛋白抑制曲霉产生的淀粉酶可达到减少毒素的产生的目的，并为防治毒素的危害提供了新思路。如果将该基因导入玉米等农作物，则可以达到抑制田间和贮存过程中黄曲霉浸染的目的。陈华等最近对枯草芽胞杆菌JA的研究发现，该菌产生的脂肽类和挥发性物质除了都有很好的抑菌效果外，两者还具有协同增效作用。枯草芽孢杆菌在农业上作为生防菌防治丝状真菌病害得到广泛应用，并取得了很好的效果。当前研究发现枯草芽孢杆菌产生的脂肽类家族中fengycin和iturin对丝状真菌具有强烈的抑制作用。而挥发性的抑菌物质还未被鉴定。根据Fernando等，Kai等报道，细菌产生的挥发性抑菌物质包括醛类、醇类、酮类和硫化物等，这些化合物往往都是特有的。细菌产生的抑菌物质除了在农业上应用外，还可以用来作为粮食、食品贮藏的防霉剂，从而积极推进绿色贮粮的进程。

Naoko等在(clonostachysrosea)IFO7063菌株中克隆到一个编码大小为30Kd碱性水解酶的基因,命名为zhd101。该基因的表达产物可以破坏ZEA的结构而使其失去毒性(图3)。

Tomoko Igawa等的研究表明，zhd101基因导入玉米后，玉米颗粒表现了很好的脱毒活性，Wi-llianms于2007选育出一个玉米新品系MP175，研究结果表明它对黄曲霉菌的抗性非常强。

有意思的是研究发现转Bt基因抗虫玉米对黄曲霉毒素、伏马毒素(fumonism)等真菌毒素的产生具有抑制作用。主要是由于转基因Bt作物减少了粮食害虫的危害，从而间接地减少了有害真菌的侵染机会。

Bluma RV等从不同的生境中分离出了56株芽孢杆菌并测定了它们在不同的温度和水活度条件下对黄曲霉和寄生曲霉的生长和产毒能力的抑制情况，最终获得了两株在水活度a(w)0.982下显著抑制黄曲霉毒素产生的菌株，其抑制机理还在研究当中。另外，人们还尝试了利用不产毒的黄曲霉和寄生曲霉防治花生感染带毒菌株。

5 真菌毒素的防控前景分析

迄今为止，包括黄曲霉、寄生曲霉、烟曲霉等10种重要曲霉的全基因组序列已经测定完成和公布。这为进一步明晰产毒真菌的生理生化特性和毒素合成的机理提供了极其难得的研究平台。利用比较基因组学的手段通过比较宿主与病原菌或病原菌与类似病原菌却无病原活性的生物的基因组(如产毒黄曲霉菌株和不产毒菌株)就可以解析菌株之间的差异，从而使研发新的防霉剂更加有的放矢。由于生物技术的迅猛发展，基于该技术创造田间应用的生物农药和储粮安全、高效的绿色防霉剂，以及培育抗真菌、脱毒品种的相关研究将会取得更大的突破。

通过解析产毒真菌菌株生理生化特点和产毒机制，在粮食作物栽培、收获、干燥和贮藏等各个环节都有更为精确的温度、水分等安全控制技术，从而为我国粮食、食品安全提供更好的技术保障。