孙长坡 王松雪

0 前言

真菌,尤其是种类众多的霉菌在人类生活中扮演着重要角色,如根霉和米曲霉为我们提供了酱制品、美酒、发酵食品等许多风味食品,但严重影响人类健康的真菌毒素也主要是由霉菌产生的,全世界每年约有25%的谷物由于真菌毒素的污染而影响食用。霉菌不仅消耗粮食、食品中的营养物质,使其质量和食用价值降低,而且会引起一系列的临床症状,严重的可造成死亡。因此自1961年英国科学家分离到第1种真菌毒素——黄曲霉毒素以来,霉菌及霉菌毒素污染所造成的损失立即引起了人们的高度重视。在粮食生产中产生危害作用的主要是黄曲霉毒素(AFT)、单端孢霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素等。它们是霉菌在生长过程中产生的次级代谢产物。由于真菌毒素严重威胁着人类的健康,相关菌株的分离鉴定和毒素检测和防治的研究不断深入。特别是分子生物学技术引入和发展使产毒菌株的分离、鉴定和毒素检测、监测迅速达到分子水平,并保证了鉴定更便捷、结果更准确。

1 产毒真菌的分子鉴定

传统的分类方法主要依据于真菌的形态、细胞的生理和生化特征,尤其是有性生殖阶段的形态特征对真菌进行分类。近年来多门新兴学科和技术的发展,特别是分子生物学技术的兴起极大地推动了真菌分类学的进步。一些已经或即将用于真菌分类研究的分子生物学技术日渐显示出重要的分类学潜能。笔者对生物学技术在粮食霉菌分类中主要应用做一概述。

1.1 DNA中G+Cmol%含量测定

该测定最早用于真菌分类学研究的分子生物学技术,目前在酵母菌的分类中应用较为成功。即利用真菌DNA中核酸序列的同源性及基因大小相似性的遗传特征,测定DNA中的碱基含量(G+Cmol%含量)作为真菌分类鉴定的重要遗传指标之一,因为每种真菌都有固定的、较为稳定的G+Cmol%值,不同生物种的G+C含量是不同的,生物种之间的亲缘关系越远,其G+C含量差别就越大,反之亦然,因而可作为真菌的分类学指标。真菌DNA中G+Cmol%为27%～70%,但该方法只能将菌株鉴定到属。

1.2 核酸分子杂交技术

该技术包括DNA-DNA/rRNA杂交分析、核酸分子探针杂交等。采用示踪物标记的一条DNA分子与另一条在适当条件下杂交,可获得两者间的杂交百分率即DNA同源性,以此判断两菌株是否属同一种。一般在相同的菌种之间,DNA/DNA杂交的成功率高达80%以上;若低于20%基本可考虑为不相关菌系;65%～80%之间的菌有较高的同源性,提示为同一属的不同种。但如结果在20%～25%范围时则难以作出判断,应同时用其他方法分析确定。对属或属以上水平的分类则采用DNA/rRNA杂交,因为rRNA在进化过程中保守性更强。随着DNA研究的深入,DNA探针在真菌分类领域的应用日益广泛。DNA探针之所以受到重视,其一是由于DNA探针与其他一些分子生物学技术结合起来,具有极高的敏感性,可对痕量DNA样品进行分析检测。根据Tm(e)值或RNA结合数可获得被测DNA分子亲缘关系的资料。Kurtzman等首先开展对黄曲霉群中各菌种的DNA关系研究,黄曲霉和寄生曲霉显示79%的DNA杂交率,而集峰曲霉和黄曲霉的DNA杂交率只有39%。Kurtzman根据这些研究结果建议把黄曲霉和寄生曲霉划为黄曲霉的2个变种,而集峰曲霉则划分为1个新种。

1.3 PCR技术

PCR(Polymerase Chain Reaction)技术现在已经广泛应用于产毒真菌的分子水平的研究工作中,并通过与其他技术的结合显示强大优越性。直接PCR分析技术主要是基于不同的引物设计扩增特异序列区分菌株之间的异同。如26S rDNA、核糖体DNA内转录间隔区(ITS)、small rDNA序列的扩增分析等。Mansfield MA等通过PCR扩增烟曲霉(A.fumigatus)中特有的编码IF-1因子和rodA基因之间大小为800bp的rDNA序列,并结合测序技术鉴定了宾西法尼亚州12个农场的贮藏玉米和饲料污染烟曲霉的情况。Bluhm B用多重PCR技术可以将产生伏马毒素和单端孢霉烯族化合物的镰刀菌区分开来,并且其灵敏度可达105CFU/g。以产毒真菌的相同序列作为扩增对象时则可以检测样品是否受到感染。PCR技术与限制性内切酶分析则能将真菌鉴定到菌种水平。另外,最新应用的Real-time PCR技术不但可以鉴定菌株,而且还可以对一些毒素的产量进行实时、定量地监测。利用Realtime PCR技术对欧洲葡萄酒中赭曲霉毒素(OTA)主要产生菌-碳黑曲霉进行了定性、定量分析,其灵敏度可达到103CFU/mL,总之PCR技术的不断改进,使得该方法在真菌的鉴定中的地位愈为重要。

1.4 RFLP技术

限制性酶切片段长度多态性,即RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism),是指在生物进化进程中,DNA碱基序列发生插入、缺失或突变,从而改变了限制性核酸内切酶(RE)的识别位点。因此,同种生物不同个体的DNA分子用同一种RE酶切,会产生不同长度的片段,在凝胶电泳时呈现不同的带型。RFLP的研究对象是基因组DNA和线粒体DNA。Akos Juhasz等研究棘孢曲霉的线粒体DNA内切酶谱,并建立了有关线粒体DNA的RFLP比较方法。RFLP技术方法简便,影响因素少,稳定性高。这种方法存在的缺点是用RE消化整个基因组DNA产生的酶切图谱往往伴有浓重的背景,使特征性酶切条带在这一背景下较难辨认。近年来将RFLP分析与其他技术如PCR技术、杂交技术结合起来,对PCR产物进行RFLP分析或将基因组DNARFLP图谱以特定探针杂交后分析杂交带的大小与数目,可弥补单纯RFLP分析时结果模糊之缺陷,另外还有TRFLP(Terminal RFLP)技术。Somashekar D通过对aflR基因的PCR-RFLP的分析可以极为灵敏地判定玉米中是否污染黄曲霉和寄生曲霉,并且可以很好的将两者区分开来。

1.5 RAPD技术

RAPD(Random amplified polymorphic DNA)分析是一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物通过PCR反应扩增靶细胞DNA,扩增产物经凝胶电泳,分析DNA片段大小和数量多态性,从而比较靶基因差异的一种技术。RAPD技术自1990年问世以来,已陆续用于酵母菌和丝状真菌的鉴定、分类和流行病学研究。RAPD对烟曲霉鉴定和分型亦有良好的应用价值。Loudon等以8聚寡核苷酸为引物,以RAPD分析了致病的19株烟曲霉,并鉴定到种的水平。潘力等利用RAPD分子标记技术对酿造工业上的16株曲霉菌进行系统发育分析,由此构建的系统进化树较好地吻合了传统的形态分类学,证实了RAPD分子标记技术在此类微生物系统发育分析中应用的可行性,也为酿造工业中检出产黄曲霉毒素的污染菌株提供了理论基础。

1.6 生物芯片技术

最近出现的生物芯片技术包括基因芯片技术(或称为DNA microarray技术)和蛋白质芯片技术。是将已知特定核苷酸片段(蛋白质)作为探针紧密有序地固定在支持物上,再与标记的待测样品进行核酸(蛋白)杂交,通过检测每个分子的杂交信号强度来获取样品分子的数量和信息,还有SSCP、PFGE和DNA序列分析和AFLP等技术。另外,利用SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)技术,可以把产生较多毒素的短菌核的菌株与产毒素长菌核的菌株区分开来。

2 毒素分子水平上的检测

2.1 PCR技术

刘秀梅以伏马毒素合成酶基因为基础,设计了3对引物,建立了伏马菌素产毒菌株PCR鉴定技术,32株分离菌株的FB产毒基因测定结果与生物合成毒素的HPLC测定结果符合率良好,同时明确了产毒菌株和非产毒菌株在核苷酸序列上的差异。陈茹等证明了黄曲霉菌aflR基因启动子序列变异与黄曲霉毒素产生是相关联的。通过对黄曲霉毒素合成的关键基因aflR基因的PCR扩增和序列的测定可以作为菌株是否产生黄曲霉毒素的初步预测。Janos Varga通过PCR检测棒曲霉毒素(patulin)合成簇上的一个关键的脱青霉基因作为毒素是否产生的依据,通过HPLC方法验证表明了相关性良好。Degola F通过RT-PCR技术检测了黄曲霉毒素合成基因簇中的aflR、aflS、aflD、aflQ和aflO5个基因的表达结果发现这5个基因的表达与黄曲霉毒素的产生表现了很好的相关性。这些PCR技术相关的方法简便快速,但必须是建立在对毒素合成机理详细分析和检测体系大量验证的基础上。比如有些黄曲霉菌株含有黄曲霉毒素合成基因,但并不产生毒素。

2.2 ELISA技术

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。目前,该技术在粮食、食品安全检测上也得到了广泛应用。利用黄曲霉和寄生曲霉产生的毒素或胞外物质作为抗原制备抗体,并利用ELISA技术直接或间接检测毒素含量,利用该方法检测玉米中黄曲霉毒素含量为0.5ng/kg和花生中1ng/kg,这是TLC方法做不到的,因此,可以作为黄曲霉毒素产生的早期预警。

另外,利用真菌毒素特异性抗体制成的一种新的净化技术,也就是免疫亲和柱纯化技术大大方便了真菌毒素的鉴定和纯化。邓舜洲等研制了脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原,这也为ELISA技术的应用提供了前提。目前国家明确要求检测的黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素和伏马毒素,现在均有商品化的检测试剂盒生产。

利用分子生物学技术常可同时完成毒素的检测和菌株的鉴定。Gancarlo Perrone利用AFLP技术结合对28S序列的分析和Calmodulin和tubulin2个基因的扩增分析对意大利葡萄酒中产生赭曲霉毒素(OTA)的菌株进行了分析发现23株碳黑曲霉中有22株可以产生OTA,15株黑曲霉中有3株可以产生OTA,20株棘孢曲霉中有5株可以产生OTA。并且与HPLC手段分析结果相吻合。该方法分辨率高、重复性好,而且具有可以开发成自动检测手段的前景。

2.3 生物传感器技术

Arduini F研究发现黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2和M1)可以抑制乙酰胆碱质酶(AChE)的活性,根据这一原理,在设定AChE的浓度、反应时间的前提下,AChE的活性下降和黄曲霉毒素的浓度(10～60ng/mL)成正比。并且该操作在3min之内就可完成,因此该方法有望进一步改善并应用于黄曲霉毒素的实际检测。

随着粮食、食品真菌毒素的研究深入,毒素合成的相关途径日益明晰,这使得生物芯片等新技术在毒素的检测提成为了可能。可把黄曲霉毒素赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、棒曲霉毒素、伏马毒素和单端孢霉烯(A和B)毒素合成相关基因的部分寡核苷酸序列做为探针制作了寡核苷酸基因芯片。通过提取病原菌的总RNA获得相应的cDNA后与芯片上的探针杂交,结果与TLC和HPLC对菌株产毒的检测结果相吻合。由于基因芯片可以进行定性、定量检测,所以可以对样品中毒素的有无和量的多少进行分析,并在实际检测污染脱氧雪腐镰刀菌烯醇的小麦时与其他方法有很好的相关性。高宏伟等通对以黑曲霉、黄曲霉、串珠镰刀菌和鲜绿青各菌的特有基因序列分析设计了4类菌的检测探针,并制作了检测芯片。结果表明基因芯片技术对检测霉菌是可行的,并有较好的开发应用前景。

基因芯片具有其他方法无与伦比的高通量特点,同时还可以定性、定量对基因的表达进行分析,这也使我们对粮食、食品中的多种产毒微生物的早期预警成为可能。同时也为我们进一步研究毒素合成的相关机理提供了技术平台。

3 展望

生物技术在依靠基因组学、蛋白质学、代谢组学一个个强大研究平台不断出现而迅猛发展的同时,并与信息学不断结合、交叉,沿着高通量、智能化、便捷的方向发展。这与国务院制定的《国家中长期科学和技术发展规划纲(2006-2020年)》中明确指出为保证我国的食品安全,要研究有效监测检测等关键技术,特别是开发食物污染防控智能化技术和高通量检验检疫安全监控技术要求相吻合;也与农业部制定的农产品加工业“十一五”规划中也明确指出为保障食品安全必须大力发展关键检测技术的开发相适应。另外,我国即将颁布实施的“食品安全法”有效贯彻更是需要强大的检测技术体系来支撑。因此开发灵敏、便捷和高通量的检测监测技术是当前的一项极为迫切的任务,同时也面临着前所未有的机遇。