李爱科 贠婷婷 张晓琳 綦文涛 韩飞 韩伟 付亭亭

近年来，一方面，我国畜牧业的高速发展，使得我国蛋白饲料资源短缺的问题日益突出；另一方面，生物技术的独特优势，使其应用领域不断扩大，以微生物发酵和酶解为主要方法的蛋白饲料资源高效转化利用技术越来越受到人们的重视。我国饲料工业“十二五”发展规划中明确要求“建设利用动物加工副产品深加工生产优质蛋白的示范基地，利用食品工业糟渣、废液经微生物发酵生产优质蛋白的示范基地”。饲料微生物发酵与酶解技术是指在人为可控制的条件下，以动、植物性副产品为主要原料，通过高效生物因子（多种微生物活菌、各种分解酶）的作用，降解部分多糖、蛋白质和脂肪等大分子物质，生成有机酸、可溶性肽等小分子物质，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料或饲料原料。发酵和酶解植物蛋白饲料较之常规蛋白饲料除含有更多小肽等易消化吸收物质外，还含有丰富的酶类、益生菌等生物活性物质，这些物质的存在大大提高了植物蛋白的营养价值，还可以改善动物肠道菌群结构，提高动物本身的免疫力。同时，原料中的抗营养因子，尤其是热不敏感类抗营养因子也得到显著地降解，减少了对动物的毒害作用，提高了原料的消化率和饲用价值。但是发酵酶解植物蛋白饲料领域也同样存在许多问题亟待解决，如优良发酵菌种的筛选；最佳发酵及酶解条件和工艺的确定；产品质量标准和稳定性的深入研究；公正、合理的产品质量评价体系等等。因此，本文简单介绍了微生物发酵与酶解技术在蛋白饲料资源开发领域应用的特点和研究现状，并对其存在的问题和未来的发展方向提出了建议。

1 微生物发酵植物蛋白饲料

1.1 微生物发酵饼粕蛋白饲料的方法与特点

微生物发酵蛋白饲料的方法包括固态发酵、液态发酵、吸附在固体表面的膜状培养以及其他形式的固定化细胞培养等，目前多以固态发酵为主。固态发酵是指微生物在没有或几乎没有自由水的固体营养基质上生长的过程，且有厌氧和好氧之分。固态发酵历史悠久，并具有培养基简单且来源广泛、投资少、能耗低、技术较简单、产物的产率较高、环境污染较少、后处理加工方便等优点，所以应用较多。

1.2 微生物发酵饼粕蛋白饲料的优势

1.2.1 显著去除饲料原料中的内源毒素及抗营养因子

油脂饼粕中的部分内源毒素及抗营养因子在不同制油工艺中，尤其在传统高温、高压压榨浸提工艺中难以去除，通过微生物发酵是有效解决这一难题的主要措施。

1.2.1.1 发酵棉粕

人们在20世纪50年代时发现，成年反刍动物具有避免游离棉酚(FG)中毒的生理现象,1960年Roberts等根据这一生理现象利用牛、羊的瘤胃微生物对棉籽饼粕进行发酵脱毒,取得成功并申请了美国专利。W.Baugher等(1969)在利用抗生素灭菌条件下，利用1株Diplodia真菌对游离棉酚(FG)成功进行“生料”发酵脱毒，脱毒率大于90％，残留FG比未脱毒棉粕中FG对动物的毒性少，此方法在仔猪、鸡日粮中取得成功应用。而微生物固态发酵法在我国是20世纪80年代后期逐渐发展起来的一种新的棉籽饼粕脱毒方法。钟英长等(1989)采用添加棉酚的培养基进行脱毒微生物的自然筛选和诱变育种，获得5株对棉酚有高脱毒率而不产黄曲霉毒素的霉菌，对未经榨油的棉籽仁粉的脱毒率可达60%～74%。施安辉等(1998)、杨继良等(2000)获得了脱游离棉酚能力较强的酵母菌。张庆华等(2007)采用热带假丝酵母、拟内胞霉和植物乳杆菌协同固态发酵,对棉粕脱毒率达85.30％；吴伟伟（2009）研究了黑曲霉与酿酒酵母混合固态发酵棉籽饼粕中游离棉酚脱毒率为95.51％。传统发酵法一般采用高温、高压灭菌，实际主要是脱除FG的因素(贾晓锋等，2009)，脱毒率可以达到95％以上，但也影响到氨基酸的消化利用；另外，不同微生物对FG脱除影响很大，部分菌种还使FG显著增高。贾晓锋(2008)采用黑曲霉和热带假丝酵母发酵棉籽粕，认为假丝酵母对棉籽粕中游离棉酚有一定的脱毒作用，而黑曲霉增加了游离棉酚的含量，二者对棉酚均无明显降解作用。而徐晶等(2012)通过对12株菌分别进行生料固态发酵得出，芽孢杆菌B12和假丝酵母Cu1组合后脱毒率可达50.03%；芽孢杆菌B12和酵母8605组合脱毒率达到52.19％。我国的学者在利用微生物固态发酵生产脱毒棉籽饼粕的研究方面做了大量的工作，主要表现在3方面：①脱毒菌种的筛选；②发酵底物组成及发酵参数优化；③发酵前后棉籽饼粕营养成分及养分利用率比较研究。

1.2.1.2 发酵菜粕

国内外关于菜籽粕发酵的研究已有诸多报道。Rozan等(1996)使用少孢根霉发酵菜籽粕40h后，总硫甙降解率为47％。蒋玉琴等(1999)利用乳酸菌、酵母菌、少孢根霉菌复合菌系发酵菜籽粕32h，硫甙降解率达71.6％。Chiou等(2000)研究表明，米曲霉菌能大幅度地改善菜籽粕中纤维素的消化率。陆豫等(2007)使用白地霉和米曲霉脱毒菜籽粕，水料比2：1，29℃发酵47h，硫甙去除率达到97％，取得了较好的效果。但是，国内外的大部分菜籽粕微生物发酸菌种并不是我国农业部(2006)允许在饲料中使用的品种，而且近年来对菜籽粕发酵多数以硫甙脱毒和提高蛋白含量等方面为主要研究目标，发酵工艺主要采用100℃以上高温灭菌，虽也能去除抗营养因子，但能源消耗大，蛋白质品质也难以保证。另外，对微生物法降解菜籽粕中的植酸、单宁等抗营养因子的研究报道也较少。

1.2.1.3 发酵豆粕

发酵豆粕与豆粕相比，能有效去除豆粕中热不敏感的抗营养因子，如抗原蛋白、植酸以及水苏糖等，尤其抗原蛋白具有抗原性和致敏性，能刺激免疫系统产生抗体，导致腹泻和生长受阻。通常热敏性抗营养因子在油脂加工过程中通过热处理已经大部分除去，如胰蛋白酶抑制因子、脲酶以及大豆凝集素等(姚琨等,2011)。李建(2009)研究表明，通过热处理胰蛋白抑制因子可从10～15mg/g降低至1mg/g以下。通过发酵处理，豆粕中的植酸、抗原蛋白等“热不敏感”抗营养因子都得到显著去除。胥九兵等(2008)发现,产蛋白酶的芽孢杆菌对抗原蛋白降解效果较好,降解率在90％以上。姜丹等(2011)发现，酵母菌单菌发酵豆粕后，胰蛋白酶抑制因子降低了58.27%，植酸降低了80.11%，豆粕中粗纤维含量也显著降低。陈洁梅等（2011）发现，发酵后大豆抗原已经完全被分解，各种主要抗营养因子的降解率达90%以上。

1.2.2 提高真蛋白质(小肽、氨基酸)含量和消化利用率

发酵过程中，微生物大量繁殖，将培养基中的非蛋白氮、无机氮、碳源及抗营养因子等各种物质分解利用转化为营养价值高的菌体蛋白。同时，通过微生物的降解，可将部分大分子的蛋白质降解为具有特殊功能的营养小肽和氨基酸。

莫重文等(2007)研究发现,米曲霉和酵母混合发酵豆粕中粗蛋白含量可达49.10％,比原料中增加12.1％。王金斌等（2009）研究发现，枯草芽孢杆菌M5094和热带假丝酵母C3161发酵豆粕，基质粗蛋白含量由31.75％上升到49.27％。陈洁梅等(2011)利用芽孢杆菌对豆粕进行固态发酵试验，发现样品中粗蛋白含量从50.6%增加到54.1%,TCA-N含量从2.4%增加到38.8%,大豆肽含量从1.8%提高到29.5%，游离氨基酸含量从5.57mg/g增加到92.65mg/g，大分子蛋白质基本上都被降解成10kD以下的小分子肽，这与吴宝昌(2010)、钱森和等(2011)、姜丹等(2011)、刘晓艳等(2011)研究结果一致。常磊等(2011)使用饲用酶与芽孢杆菌协同作用发酵豆粕,其酸溶性蛋白含量从2.74％增加到24.55％，乳酸含量从1.26％增加到4.70％，各种抗营养因子也大都得到降解，大分子蛋白降低至20kD以下。傅珏等研究发现，发酵增效剂Ⅲ提高发酵豆粕肽含量的能力最强，在较优水平即：添加量5kg/t、料水比3：7、39℃条件下，发酵豆粕产肽量达19.67%，较空白组提高了208.31%。

张庆华等采用热带假丝酵母、拟内胞霉和植物乳杆菌协同固态发酵棉粕，粗蛋白含量从30.05％提高到34.50％。吴伟伟等研究了黑曲霉与酿酒酵母混合固态发酵棉籽饼粕，真蛋白质含量从32.99％提高到42.40％，必需氨基酸中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量分别较发酵前相比增加了31.03%、25.00％和44.23%。贾晓锋等(2008、2009)采用黑曲霉和热带假丝酵母发酵棉籽粕，黑曲霉具有较强的蛋白降解能力，可将高分子质量的棉籽蛋白降解为14Ku以下的小分子蛋白和小分子肽。刘俊等(2010)研究发现，混菌发酵后棉粕TCA-NSI(三氯乙酸氮溶指数)提高了25.34%,小分子多肽含量提高了11%,游离必需氨基酸提高了24%。刘俊(2011)的研究进一步发现，棉粕经混菌发酵后氨基酸组成更趋于平衡，这也与蒋金津(2010)、夏新成等(2010)、诸葛斌等(2011)、金红春(2011)等研究结论一致。蒋金津(2010)发现，棉粕和发酵棉粕在肉仔鸡消化道内水解释放小分子肽的比例有显著差异，其比例高低为：发酵棉粕＞发酵棉蛋白＞棉蛋白＞棉粕＞鱼粉＞酶解棉蛋白＞酶解棉粕＞豆粕。

1.2.3 增加饲料中酶类、益生菌等生物活性物质含量

发酵植物蛋白较之普通植物蛋白多了很多生物活性因子，对促进动物生长，提高动物饲料转化效率等有积极作用。同时，产品中含有的大量酵母菌体等益生菌，可改善动物的肠道微生态，提高动物免疫力。

金红春(2011)研究证实，棉粕经过发酵后，淀粉酶活力提高了766U/g、纤维素酶活力提高了494U/g、脂肪酶活力提高了249U/g。徐晶等(2012)研究发现，发酵后棉粕中蛋白酶含量为664.17U/g,淀粉酶含量为471.73U/g,酵母菌含量为2×10⁶cfu/g，芽孢杆菌含量为1.3×10⁸cfu/g。邱良伟(2012)研究发现，发酵棉粕中芽孢杆菌和酵母菌的总活菌数可达4.6×10⁸cfu/g。刘天蒙(2011)发现，米曲霉固态发酵豆粕产生的蛋白酶酶活最高为975.74U/g。吴宝昌(2010)、熊涛等(2011)、陈洁梅等(2011)利用枯草芽孢杆菌与其他菌混菌发酵后，豆粕中酶活大大提高。

1.3 发酵蛋白饲料的应用效果

发酵类产品在饲用过程中的优势主要表现在：提高日增重、改善饲料品质、改善养殖环境、改善动物健康等。

禚梅等（2012）研究日粮中添加棉仁蛋白、发酵棉粕以及发酵棉粕+能量代替豆粕对蛋鸡产蛋后期生产性能的影响,发现日粮中添加5%发酵棉粕代替豆粕组产蛋后期蛋鸡的产蛋率、料蛋比、体重增长、经济效益指标优于其他组。陈道仁等(2010)、朱献章等(2010)、汤江武等(2011)在鱼、猪、肉鸡日粮中添加发酵棉粕也得到了较好的应用结果。刘海燕(2010)、刘欣等(2007)发现，发酵豆粕可促进仔猪生长、增强仔猪免疫力、提高饲料转化效率。游金明（2008）、季天荣等(2008)、胡永娜等（2012）研究了发酵菜粕替代豆粕在肉鸡、断奶仔猪日粮中的应用效果，也得出相似的结论。

1.4 发酵蛋白饲料存在的问题

①发酵原料的安全性：如豆粕和花生粕中可能存在的黄曲霉毒素。

②发酵所用微生物的安全性：固态发酵棉粕环境相对开放，在发酵过程中容易感染其他杂菌，甚至是有害菌。

③产品质量的稳定性：由于固态发酵工艺本身的开放式操作，对发酵时间、温度、水分控制等大都靠生产人员的经验，因此，保证产品质量的稳定是关键。

④相应的质量评价标准的制定：市场上的产品良莠不齐，但由于缺乏相应的质量评价标准，使得消费者很难辨别真伪。

⑤不同动物饲粮中最适添加比例的确定：发酵植物性蛋白饲料原料是以植物蛋白为原料的产品，其氨基酸组成和含量千差万别。如何确定发酵植物蛋白类饲料种类及其在饲料中的最佳使用比例、降低饲料成本等问题还有待于科研部门深入探索、生产厂家不断完善工艺和广大用户不断积累经验。

⑥加工设备低、水平重复、开发能力不足、标准水平低：目前的实际生产大都采用通用加工设备，技术相对落后、生产环境恶劣、劳动强度大、对物料的适应性差、产品质量不稳定、生产规模小、自动化程度低，不能完全适应生物饲料加工的需要，这些已成为发酵类饲料生产和发展的制约因素（高翔，2011）。

2 酶解植物蛋白饲料资源

酶解是指在适宜的条件下利用酶的作用，将大分子物质降解为小分子物质的过程。酶法水解蛋白较酸、碱水解法具有许多无可比拟的优点，如反应条件温和、产品纯度高、不产生消旋作用、不破坏氨基酸,其主要产物是肽而不是氨基酸等(刘静，2006、2010)。

2.1 酶解方式

酶解蛋白饲料有两种生产方式，一种是直接在原料中添加特定的酶，并将条件调整到该酶的最适条件，以得到预期产物。目前常用的酶主要有：Alcalase碱性蛋白酶、Flavourzyme复合风味酶、Protease A和Peptidase R、胃-胰蛋白酶等。另一种酶解是指通过微生物发酵产酶直接酶解蛋白质饲料资源，一般通过筛选适宜在蛋白质底物上优良表达的菌株，以菌株分泌的蛋白酶在体外将蛋白质酶切成长短不一的肽段。由于菌株代谢产物往往不是某种单一确定的酶，微生物发酵降解蛋白质的同时往往还具有脱毒、除去饼粕中的抗营养因子等能力。

2.2 酶解的研究及应用现状

微生物发酵酶解法在大豆肽生产中技术较成熟，也得到了较广泛的应用。目前采用的微生物主要有：嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉等。米曲霉降解豆粕的效果最好，芽孢菌则能繁殖出大量的以芽孢形式存在的益生菌，而采用嗜酸乳杆菌发酵豆粕使产物粗蛋白含量有所提高(3.49%)。王文娟等（2007）采用黑曲霉发酵大豆饼粕也取得了良好效果，获得的大豆蛋白混合肽含量达60%以上。微生物发酵法生产小肽具有复合酶解作用，例如部分菌株还能同时去除小肽苦味。万琦等(2003)报道了1株用于大豆肽的枯草芽孢杆菌产羧肽酶，将短肽末端的疏水性氨基酸切除，从而实现了酶解和脱苦一步完成的大豆多肽发酵生产。郭涛等（2005）发现，中性蛋白酶AS1.398水解菜籽蛋白酶解后有75%左右的蛋白质转化为可溶性肽。通常复合酶解效果要优于单一酶解，如Alcalase碱性蛋白酶和Flavourzyme复合风味酶双酶对菜籽清蛋白进行分步水解能将水解度由单酶的14.72%提高至28.10%。周乃继（2009）、蒋金津等（2010）建立了Alcalase酶和Flavourzyme酶复合酶解棉、菜籽粕的复合酶解工艺，并分别成功制成酶解棉籽粕和酶解菜籽粕产品。酶解大豆、花生、玉米肽虽然已在食品工业中得到应用，但由于生产成本偏高，在饲料工业中的应用仍有局限性。

2.3 酶解饲料蛋白资源存在的问题

酶法水解蛋白的主要目的产物是各种功能性小肽。小肽制品高度安全且性能卓越，既有丰富的营养性作用又有防病抗病等功能作用，可以预见，肽制剂将成为继维生素、氨基酸后在饲料中又一种必不可少的添加物。因此，探讨小肽的转运、吸收、代谢及其作用形式可为进一步发展蛋白质营养理论开辟一条新路，研究如何降低酶解成本，着手开发和研制廉价、高效、安全和无污染的小肽制品并应用于畜牧业生产实践，对于更加充分地利用蛋白质资源，改变我国蛋白质资源短缺局面，提高畜牧业及水产业整体生产水平有很大的益处。另外，酶解小肽的评价标准以及对功能性肽的认定也很关键。由于肽类物质具有许多生理活性，国外对各类食品用肽产品开发与应用方面的研究非常活跃,研究范围广泛,因此，系统建立蛋白肽评价体系也是当务之急。

3 发酵与酶解植物性蛋白饲料研究进展与发展方向

发酵和酶解都属于在植物性蛋白饲料资源开发利用中的生物技术手段，统称为生物蛋白饲料，两种技术都极大地改善了植物蛋白饲料的营养特性，扩大了其在饲料中的应用范围。我国的发酵工业已取得了长足的发展，微生物发酵对大豆、棉籽及菜籽饼粕中的有毒、有害物质及抗营养因子的去除效果明显，对蛋白质大分子降解为小肽等的作用显著，能提高蛋白质及NSP类营养物质的消化利用率，达到节约饲料消耗的目的。通过新型发酵豆粕、棉粕及菜粕等产品开发，不仅能使饼粕中抗营养因子及有毒、有害物质进一步降低到一个最低的水平，而且能使饼粕总蛋白分子的肽键降解50%以上，这在开发小肽营养产品和功能性肽产品方面将有很大的潜力。另外，应用生物技术如酶工程技术，可开发高蛋白质含量的浓缩蛋白等系列产品，如大豆、棉籽、菜籽浓缩蛋白（CP≥65%），这也将进一步扩大饼粕饲料产品的用途。总之，以植物蛋白生产的新型生物蛋白饲料作为一个新型的饲料资源，无论从理论上还是实践上，均需要进一步发展和完善，尤其在检测技术、评价技术、掺杂使假的防控上应引起各方重视。随着微生物学、饲料学等众多学科的交叉发展，菌体蛋白开发技术将会有所飞跃，这对缓解我国饲料原料紧张的局面，推动饲料工业和畜牧业的发展都具有广阔的前景。