惠明 李莉媛 张晓琳 韩伟 郭伟群

益生菌制剂作为饲用抗生素替代产品之一，越来越受到人们的重视。例如，益生菌能够调节动物消化道的微生态区系平衡，通过补给优势菌株，在动物肠道帮助建立和维持正常的肠道优势种群，可有效排除或控制潜在的病原菌；促进动物生长，能够合成维生素K、B族维生素、β－胡萝卜素等可被动物直接吸收利用，从而加强动物的营养代谢；可产生非特异性免疫调节因子，产生干扰素，或作为免疫复活剂，刺激胃肠非特异性局部免疫，从而提高免疫球蛋白浓度和巨噬细胞的活性，增强机体免疫功能和抗病力等。

肠球菌为消化道内正常存在的一类微生物，在肠黏膜具有较强的耐受和定植能力，并且是一种兼性厌氧的乳酸菌，与厌氧、培养保存条件苛刻的双歧杆菌相比，更适合于生产和应用。1989年美国FDA就公布它为可直接用于动物的菌种之一。我国农业部第1126号公告公布允许使用的饲料添加剂品种目录(2008)中，微生物饲料添加剂有16种，屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和乳酸肠球菌(Lactococcus lactis)也都包括在内。一般认为，优良的益生菌菌株应来自动物体内，能够耐受胃肠道内环境、生长快、能产乳酸、抑制病原菌生长及能够在肠道内定植等。本试验从6日龄健康AA肉仔鸡肠道中分离出7株肠球菌，从益生学角度出发评价其体外生物学性能，最后筛选出综合性能较好的一株菌，为开发饲用益生菌产品提供菌株来源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

大肠杆菌K88(Escherichia coli K88)、大肠杆菌K99(Escherichia coli K99)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella

multocida)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach):中国兽医菌种保藏管理中心(CVCC)；对照菌粪肠球菌CGMCC1.0130:中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

1.1.2 主要仪器

HVE－50高压蒸汽灭菌锅:日本Hirayama公司；YS100双目生物显微镜:日本Nikon公司；Microstation自动微生物鉴定仪:美国Biolog公司；SW－CJX－2F净化工作室:苏州汇通空调净化工程有限公司；SBA－40C生物传感仪:山东省科学院生物研究所；Mastercycler普通PCR仪:德国艾本德股份公司；DYY－6C电泳仪:北京市六一仪器厂。

1.1.3 培养基配方

肠球菌选择性培养基(EC):蛋白胨2g，酵母浸膏0.5g，葡萄糖0.2g，Na₂HPO₄ 0.4g，K₂HPO₄ 0.4g，琼脂2g，双蒸水100mL，pH 7.4，冷至45～50℃，加入NaN₃至终浓度为0.4mg/mL，2，3，5－氯化三苯四氮唑(TTC)至0.1mg/mL。

MRS液体培养基:蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，K₂HPO₄ 2g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，Tween－80 1mL，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·H₂O 0.25g，1000mL蒸馏水，用1mol/L NaOH调节至pH 7.0，115℃灭菌30min。MRS固体培养基是在液体培养基的基础上加入1.5%的琼脂。

LB液体培养基:胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，1000mL蒸馏水，用5mol/L NaOH调节至pH 7.0，121℃灭菌20min。LB固体培养基是在液体培养基的基础上加入1.5%的琼脂。

1.2 试验方法

1.2.1 肠球菌的分离

采集健康6日龄AA肉仔鸡空肠、回肠、盲肠肠道内容物，用灭菌的载玻片刮取黏液，用灭菌生理盐水稀释到10^－4，取0.1mL涂布于肠球菌选择性培养基(EC)平板上，37℃厌氧培养24h，挑取有蓝黑色环带，表面光滑凸起，周边整齐，直径1.0～1.5mm的菌落，转接于EC基础斜面，涂片，革兰氏染色镜检，筛选G⁺，呈圆形或卵圆形，单个、成对或短链状排列的菌株，20%甘油保种，－20℃冰箱保存备用。

1.2.2 Biolog菌种鉴定

按照Biolog GP2微生物鉴定仪使用手册和Biolog微生物自动分析系统－细菌鉴定操作规程的研究所述的操作步骤进行Biolog菌种鉴定。

1.2.3 16S rRNA鉴定

1.2.3.1 总DNA的提取

用Progema Wizard Genomic DNA提取试剂盒提取菌株总DNA。

1.2.3.2 PCR 扩增及测序

正向引物:5'－GAGTTTGAT CCT GGC TCAGGACGA－3'，反向引物: 5'－CGC ACC TTC CGATACGGG CTA CCT－3'由上海英骏生物技术有限公司合成。反应体系:正向引物(24bp)1μL，反向引物(24bp)1μL，10×Buffer 5μL，Mg²⁺4μL，dNTP 2μL，Ex-Taq酶1μL，模板3μL，ddH₂O 35μL。反应程序:预变性95℃，5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸5min。取10μL扩增产物加入2μL溴酚蓝染色液，混匀加在1%琼脂糖凝胶(含goldview 2.5μL)，1×TAE缓冲液中恒压80V电泳45min，用凝胶成像仪观察结果。将PCR反应产物直接送至上海英骏生物技术有限公司进行测序。

1.2.4 生长曲线与乳酸代谢曲线的测定

将甘油低温保存的各菌株按1%接入到MRS液体培养基中培养8h作为种子。将1mL种子液分别加入100mL的MRS培养基中，在37℃，150r/min培养18h，每2h取样一次，以MRS液为对照，对所取样品分别测定OD₆₀₀，每个处理3个重复，记录数据绘制生长曲线。同时使用生物传感仪分别测定各时间点菌体培养液中乳酸产量，重复3次，记录数据绘制乳酸代谢曲线。

1.2.5 抑菌活性的测定

采用牛津杯法测定各菌株对致病型大肠杆菌K88/K99、多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的抑制能力。

1.2.6 人工胃、肠液耐受性测定

人工胃液配方:取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为1.5、2.5和3.5，然后按照每100mL加1g的量加入胃蛋白酶，充分溶解，微孔滤膜(0.22μm)除菌，待用。

人工肠液配方:取KH₂PO₄ 6.8g，加蒸馏水500mL溶解，用质量分数4g/L NaOH溶液调至pH 6.8，加水稀释至1000mL，按照每100mL加1g的量加入胃蛋白酶，充分溶解，微孔滤膜除菌(0.22μm)，待用。

将活化后的菌株分别以10%接种量接入上述人工胃、肠液中，每个处理设3个重复，37℃恒温培养1.5h，利用平板菌落计数法测定菌数并计算存活率。

1.2.7 数据处理

使用Origin8.0制图，SPSS16.0进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

2.1.1 形态观察

经菌落形态和显微形态观察，分离的7株菌均符合肠球菌的形态特征。在肠球菌选择性培养基上菌落周围有蓝黑色环带，表面光滑凸起，周边整齐，单菌落直径1.0～2.0mm，革兰氏染色为G⁺，圆形或卵圆形，成对或短链状排列，分别编号为:GJ01007、GJ01010、GJ01011、GJ01012、GJ01013、GJ01014和GJ01015。图1为GJ01013的菌落形态及显微形态图。

2.1.2 Biolog鉴定结果

Biolog微生物自动分析系统主要根据细菌对糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等95种碳源的利用情况进行鉴定。7株菌鉴定结果均为种名，如表1所示。

2.1.3 16S rRNA鉴定结果

16S rRNA基因含有高度保守的基因片段，大约1.5Kb，由图2可以看出，7株菌在1000～2000bp间均有明显的条带，1.5kb左右，这表明PCR反应扩增出了预期长度的16S rDNA序列。将测序得到的结果应用BLAST程序在GenBank数据库中进行相似性比较，得出GJ01007、GJ01010、GJ01011、GJ01012和GJ01015与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的同源性为99%，GJ01013和GJ01014与屎肠球菌(Enterococcus faecium)的同源性为100%。

2.2 菌株的生长、产乳酸性能

肠球菌生长速度快、代时短和产乳酸能力强是其作为益生菌制剂的一个很大优势。如图3、图4所示，7株菌在1～2h就进入了对数增长期，并持续到8h，之后进入稳定期。随着菌体的生长，乳酸产量也逐渐升高，在14h后基本趋于稳定。通过与对照菌株Ef1.0130和其他菌株相比较，GJ01013代时＜30min、延滞期短、最大生长比速率为0.35h^－1、稳定期菌数高，且乳酸最终产量可达6.5g/L。

2.3 抑菌能力

致病型大肠杆菌K88/K99、多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门氏菌及金黄色葡萄球菌是较为常见的动物致病菌，对致病菌的抑菌活性是肠球菌作为益生菌制剂的一个必要前提。由图5可知，这7株菌对以上5株常见致病菌均有一定的抑制能力，相比对照菌Ef1.0130和其他菌株，GJ01013对5株致病菌均有较强的抑制能力，抑菌圈直径均在15mm以上，对大肠杆菌K88的抑菌圈直径可达21.5mm。

2.4 人工胃、肠液耐受性

胃液pH的大小根据饮食结构的不同而波动，通常在pH 3.0左右，这种酸性环境可以激活胃液中的胃蛋白酶原，从而杀死胃内的细菌，食物通过胃的时间相对较短，一般为1～2h。小肠液的pH约为7.6，其中除了大量的水分外，还有各种酶、胆汁盐等多种成分，对肠内菌群有着多方面的影响，食物通过动物小肠的平均时间约为1.5h。因此保持一定数量的活菌数是其发挥作用的先决条件。

由图6可以看出7株菌对人工胃液都表现有耐受性，不同pH胃液的存活率分别在20%、50%和70%以上。对人工肠液也有一定的耐受性，存活率均在60%以上。综合比较，菌株GJ01013耐胃、肠液能力相对较强。

3 讨论与结论

Biolog自动微生物分析系统与传统鉴定方法相比，具有快速、便捷、有效的特点，特别是对于没有目的性的未知微生物，可为鉴定者提供方向性指导。除GJ01012的Biolog鉴定结果与16S rRNA序列分析结果不一致外，其余菌株的两种鉴定方法结果均一致。考虑到Biolog自动微生物分析系统在其数据比对过程中记入一些非特异性的阳性反应，会造成偶然误差，从而引起个别鉴定结果的不稳定，GJ01012的鉴定结果暂以16S rRNA序列分析结果为准，还有待进一步准确印证。

上述从6日龄肉仔鸡肠道中分离得到的7株肠球菌，通过体外益生性能评价后，经数据综合分析，与对照菌株和其他菌株相比，筛选出一株Enterococcus faecium GJ01013，具有生长速度快，产L－乳酸能力强，能抑制致病型大肠杆菌K88/K99、多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的生长和耐人工胃肠液等优良特性，为新型饲用微生态制剂的开发提供菌种来源。