郭伟群 邹球龙 陈园 李能威 张晓琳

多杀菌素(spinosad)是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经好氧发酵产生的胞内次级代谢产物，它通过刺激昆虫的神经系统，导致非功能性的肌肉收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹，是一种具有快速触杀和摄食毒性的新型微生物源杀虫剂。多杀菌素作用方式独特、选择性高、具有对非靶标动物安全以及降解产物安全等优异特性，在1999年、2008年、2010年3次获得美国总统绿色化学品挑战奖(USA Presidential Green Chemistry Challenge Award)，在防治仓储和田间害虫以及动物寄生虫方面具有良好的应用价值和广阔的市场前景。

多杀菌素在中国的发明专利已经到期，但因为涉及专利持有人美国陶氏益农公司的商业秘密，目前多杀菌素的生产、销售、应用环节都被陶氏公司独家垄断，国内多杀菌素的市场领域还处于空窗期，满足多杀菌素工业生产的菌种也未见报道。经过20多年的研究，尽管对多杀菌素的理化性质、生物合 成等已经有了一定的了解，但在对刺糖多孢菌的遗传背景、代谢途径尚未完全清楚的情况下，常规育种方法仍是获得高产突变株的有效手段。本文研究了⁶⁰Co-γ射线对刺糖多孢菌的诱变效应，并对获得高产菌株的代谢情况进行考察，为多杀菌素工业生产菌种的选育及工艺的研究做了有益的探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)N-19由国家粮食局科学研究院发酵生物技术实验室筛选和保藏。

1.1.2 培养基

斜面和平板培养基(g/L)：葡萄糖5.0，牛肉膏3.0，酪蛋白胨0.25，琼脂15.0，去离子水1升，pH 7.2，115℃灭菌25min。

摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖15.0，可溶性淀粉10.0，豆饼粉3.0，棉籽蛋白3.0，大豆蛋白胨25.0，MgSO₄·7H₂O 2.0，去离子水1L，pH 7.2，115℃灭菌25min。

摇瓶发酵培养基(g/L)：葡萄糖50.0，棉籽蛋白20.0，NaCl 3.0，K₂HPO₄·3H₂O 1.0，FeSO₄·7H₂O 0.05，CaCO₃ 1.0，去离子水1L，pH 7.2，115℃灭菌25min。

1.1.3 主要试剂和仪器设备

CH₃CN和CH₃OH(色谱纯，德国Merck公司)，Spinosad标准品(纯度为98%，美国Sigma公司)，钴源由北京大学化学院提供。

摇床(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；生化培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司HPS-400)；离心机(德国Eppendorf公司)；高效液相色谱仪(美国Waters公司515型)；紫外检测器(美国Waters公司2487型)；全自动还原糖测定仪(SGD-IV)；生物传感分析仪(SBA-40C)；pH计(梅特勒DELTA320)。

1.2 方法

1.2.1 孢子悬液的制备

茄形瓶斜面培养基接种出发菌株，28～30℃培养8～10d；取孢子成熟的新鲜斜面，加入0.02%无菌葡萄糖溶液进行冲洗，将斜面表面的孢子轻轻刮下，移入100mL带玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡将孢子打散，利用自制孢子过滤器滤除菌丝、培养基制得孢子悬液，调整孢子浓度约10⁸个/mL。

1.2.2 ⁶⁰Co-γ射线诱变

取孢子悬液原液，用无菌水稀释孢子悬液至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释度，取10^-3、10^-4、10^-5等稀释度各0.1mL涂平板做对照，每个稀释度3个重复，28～30℃培养8～10d，记录菌落数做为空白对照；将孢子悬液分装入无菌试管进行⁶⁰Co辐照诱变，作用剂量分别为30Gy、60Gy、90Gy、120Gy、150Gy、200Gy、400Gy和600Gy，每个处理分别取10^-3、10^-4、10^-5稀释度的孢子悬液各0.1mL涂平板，各3个重复，28～30℃培养8～10d，记录菌落数。

1.2.3 刺糖多孢菌的发酵方法

种子摇瓶：300mL三角瓶种子液装量为50mL，29℃培养60～70h，摇床转速200r/min；发酵摇瓶：300mL三角瓶发酵液装量为50mL，29℃培养

10～12d，摇床转速240r/min。

1.2.4 发酵液分析方法

多杀菌素产量测定：2mL发酵液加入2mL无水甲醇浸提，充分震荡后提取90min，10000r/min离心1min，取上清进行HPLC分析。HPLC分析条件：安捷伦XDB-C₁₈反向色谱柱；流动相V_甲醇:V_乙腈:V_{0.05%乙酸铵水溶液}=45:45:10；流速1mL/min；检测波长254nm，根据积分面积，计算多杀菌素产量。

生物量的测定：取摇匀的发酵液10mL加入离心试管内，4000r/min离心10min，测定上清液体积，估算生物量。

氨氮的测定：甲醛法。

还原糖的测定：全自动还原糖测定仪(菲林试剂法)。

葡萄糖的测定：生物传感分析仪(葡萄糖酶膜法)。

1.2.5 数据处理

数据处理采用Oringe软件、Excel软件。

突变株发酵产量提高10%以上的菌株统计为正突变菌株；突变株发酵产量下降10%以上的菌株统计为负突变菌株。

多杀菌素产量=平均值±标准偏差

突变率=正突变率+负突变率

致死率(%) =(诱变前的总菌落数-诱变处理后的总菌落数) ×100%/诱变前总菌落数

2 结果与分析

2.1 ⁶⁰Co-γ射线对刺糖多孢菌的诱变效应

⁶⁰Co-γ射线辐照对刺糖多孢菌的致死效应明显，辐照剂量120Gy时刺糖多胞菌的致死率已经达到90%，当辐照剂量达到400Gy时菌株的死亡率接近100%，仅获得5株突变株且产量很低，故不统计分析400Gy、600Gy剂量(图1)。对刺糖多孢菌的突变率进行分析发现：在90Gy、120Gy辐照剂量下，致死率在90%左右，筛选到的正突变菌株较多，这与报道相符(图2)；如表1所示：产量提高幅度最大菌株出现在150Gy的辐照剂量，而低辐照剂量和高辐照剂量都有产量大幅提高菌株出现，说明 γ射线辐照对多杀菌素的产量影响是随机的。

2.2 突变株的遗传稳定性考察

以N-19为出发菌株进行辐照诱变，挑取6个辐照剂量300余单菌落进行发酵培养，经过初筛、复筛，多杀菌素发酵产量提高10%以上的高产突变株共13株，提高20%以上的高产突变菌株3株，产量提高幅度最高达34%。多杀菌素高产突变株编号及产量如表1所示。

突变株由于自身修复机制及遗传性状的不稳定等原因在传代中可能出现表型延迟现象，导致筛选到的高产菌株经传代后发酵产量降低或高产性状丢失。对筛选到的高产突变株进行了遗传稳定性的验证，虽然部分菌株出现高产性状丢失现象，但仍有4株菌性状稳定，传代后多杀菌素产量性状波动不大，结果如图3所示。

2.3 高产突变株代谢曲线的考察

选择高产性状稳定，且产量提高幅度较大的C-30-39突变株作为进一步的实验菌株，考察突变株的代谢曲线。图4显示刺糖多孢菌C-30-39在基础发酵培养基中延滞期较短，很快进入对数生长期，多杀菌素的产生与生物量的增加呈正相关；发酵后期，随着菌体自溶，多杀菌素的产量也出现下滑。据此推测：增加刺糖多孢菌的生物量，延长菌体生长稳定期可能进一步提高多杀菌素的产量。pH、还原糖、葡萄糖和氨氮的变化也间接反映出发酵液中菌丝体的生长周期：菌体生长营养物质被快速消耗，pH显著降低，生物量迅速提高，还原糖、葡萄糖浓度迅速降低；发酵液中营养耗尽，菌丝开始断裂、自溶导致氨态氮浓度迅速升高，pH随之快速上升。

3 讨论

本研究以多杀菌素产量为指标考察了⁶⁰Co-γ射线辐照对刺糖多孢菌的诱变效果，⁶⁰Co-γ射线辐照对刺糖多孢菌孢子具有很强的杀伤力，能够使菌株的遗传性状发生改变，通过辐照诱变筛选到多杀菌素发酵产量提高的高产突变株13株，经过传代试验验证，获得遗传性状稳定的高产突变株4株。⁶⁰Co-γ射线辐照剂量在90-120Gy之间，刺糖多孢菌的正突变率较高，但突变率与高产性状及其性状稳定性并没有相关性。国内关于⁶⁰Co-γ射线诱变选育抗生素生产菌株的报道很多：孟佑婷等利用⁶⁰Co-γ射线辐照选育阿维链霉菌B1a产量提高菌株，获得3株B1a产量提高30%以上菌株；程艳等利用⁶⁰Co-γ射线辐照选育武夷霉素高产菌株，获得产量提高30%以上遗传稳定菌株一株，上述研究结果表明： ⁶⁰Co-γ射线辐照诱变选育多杀菌素高产菌株是一种可行的方法。

次级代谢产物的产率、产量的提高可以采取不同的策略，主要取决于我们对目标菌株代谢调节理解的程度。除了菌种改造方法外，对培养基、培养条件的研究以及对代谢网络的了解也是十分必要的手段，对多杀菌素高产突变株代谢曲线的研究正是这样一项基础工作，为多杀菌素发酵产量的进一步提高提供技术积累。