程亮 伍松陵 沈晗 孙长坡

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名为呕吐毒素(vomitoxin)，其化学名称为3，7，15－三羟基－12，13－环氧单端孢霉－9－烯－8－酮，为雪腐镰刀菌烯醇的脱氧衍生物，是单端孢霉烯族毒素中的一种，主要是某些镰刀菌产生的次级代谢产物，广泛存在于污染的小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物和饲料中。

畜禽DON中毒症状主要表现为拒食、呕吐、免疫力下降、母畜不孕或流产以及死亡等；慢性蓄积会导致畜禽食欲减退、日增重下降、营养不良、神经内分泌改变、免疫抑制等。DON具有很强的细胞毒性，它对于原核细胞、真核细胞、植物细胞、肿瘤细胞等均具有明显的毒性作用。DON对红细胞具有溶血作用，还可作用于骨髓造血细胞产生细胞毒性，也作用于T细胞、B细胞、IgA+细胞产生免疫毒性作用，抑制或增加细胞程序死亡。多数研究都表明DON具有胚胎毒性和致畸作用。动物试验表明，长期小剂量饲喂含DON或其它毒素的饲料，可以诱发不同器官的肿瘤。

目前国内外较为普遍的去除真菌毒素的方法主要有物理吸附、化学处理和生物转化等。物理吸附主要是吸附一些有极性的真菌毒素，并不是真正去除。化学方法可以破坏大多数真菌毒素，但破坏了营养成分并影响适口性。生物转化将真菌毒素转化或代谢为无害的产物，而且不会导致营养成分丢失，不改变适口性，因而被认为是去除饲料中真菌毒素的最佳方法。本实验室从土壤中分离到一株能以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为唯一碳源生长并转化DON的细菌，以用于DON的生物转化和霉变粮食的脱毒。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品和试剂

筛选样品采自全国各地受DON污染的土壤和粮食样品。

生物降解实验中使用的DON为经本实验室固态发酵提纯获得；DON标准品购自美国Sigma公司。

PCR、克隆pMD19－T载体、连接所用试剂均购自TaKaRa公司；PCR产物胶回收试剂购自Axygen公司；其它所用试剂为常用生化试剂。

1.1.2 培养基

基础富集培养基:蛋白胨10g，NaCl 1g，KH₂PO₄ 1g，葡萄糖1g，加水1L，调ph至7.0。无机盐(MSM) 培养基:(NH₄)₂SO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂ 0.05g，Na₂HPO₄ 2.44g，KH₂PO₄ 1.52g，加水至1L，调ph至7.0。

1.1.3 仪器设备

高效液相色谱(e2695):美国WATERS公司；厌氧工作站:英国RUSKINN公司；二级生物安全柜:美国ESCO公司；PCR仪:美国BIO－RAd公司；凝胶成像仪:美国BIO－RAd公司。

1.2 方法

1.2.1 分离和纯化

准确称取1g样品加入到2mL基础富集培养基中，加入DON至终浓度为20μg/mL，220r/min、30℃培养7d；吸取100μL培养液至含40μg/mL DON的新鲜基础富集培养基中，同条件下培养7天；再吸取100μL培养液至含60μg/mL DON的新鲜基础富集培养基中，同条件下培养7天。

吸取100μL培养液，4000r/min离心5min，吸去上清，用100μL含100μg/mLDON的MSM液体培养基悬浮沉淀，涂布于MSM平板上。30℃下培养直至长出单菌落。

1.2.2 降解DON菌株的筛选

挑取单菌落接种于含有100μg/Ml DON的无机盐培养基中，30℃，220r/min，摇瓶培养14d后，55℃旋转真空蒸干，用等体积色谱甲醇复溶，超声30min后漩涡振荡过0.22μm有机相滤膜，再稀释10倍经高效液相色谱(HPLC)检测降解效果，从而获得有降解效果的菌株。

1.2.3 DON的检测

以不接菌的无机盐培养基为阴性对照，以加DON的无机盐培养基为阳性对照，用带有紫外检测器(2489系列)的HPLC(Waters 2695系统)检测降解后培养基中DON的含量。HPLC检测条件:Waters Xbridge C18柱(5μm 4.6mm×250mm)，柱温35℃，样品温度25℃，进样量10μL，流动相甲醇/水(20∶80)，流速1mL/min，紫外检测波长λ=218nm。

1.2.4 菌株的鉴定

(1)形态鉴定:将获得的菌株在LB平板划线，30℃培养至长出单菌落，观察菌落形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等。对菌株进行革兰氏染色，再用ZEISS Imager.A2显微镜观察形态特征并拍照。

(2)16SrDNA鉴定:细菌通用物:16SF(5'－ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCT－3')，16SR(5'－TAACAAGGTAACCGTAGGGGA－3')。提取细菌基因组DNA，PCR扩增16SrDNA片段。PCR反应体系:DNA 1.5μL，2×Taq Mix 25μL，16SF、16SR各1μL，ddH₂O 21.5μL。PCR反应程序:94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环，72℃延伸8min，4℃保存。PCR产物经胶回收后，16℃连接过夜，连接体系为:Solution Ⅰ 5μL，DNA 4μL，pMD19－T Vector1μL。

连接产物热转化至Jm109感受态中，37℃过夜培养，经PCR及酶切鉴定克隆正确后送invitrogen公司测序。

(3)序列的数据处理。测序结果在NCBI使用BLAST比对，从GenBank数据库中获得与菌株16Sr DNA同源的序列数据，利用Clustalx多序列比对，在MEGA5软件中采用Neighbor－joining方法构建系统进化树(遗传距离计算采用Kimura 2－parameter model)，重复取样1000次进行Bootstrap method分析，以评估其拓扑结构的稳定性。

2 结果与分析

2.1 DON降解菌初筛及验证

从134个样品中，筛选出598个能在含DON的MSM无机盐平板上生长的菌株。逐一接入含DON的无机盐培养基中验证降解效果。经HPLC分析表明，有5个菌株降解效果相对较高(图1)，其中ASAGd4号菌株降解效果达56.6%。

2.2 降解菌的鉴定

2.2.1 降解菌形态学特征

筛选得到的ASAGd4降解菌的菌落特征为:菌落不规则圆形，边缘粗糙，白色，菌落四周隆起，表面有皱褶，正反面同色，培养基不变色，较湿润，质地均匀，易挑取(图2)。革兰氏染色为阴性，杆菌(图3)。

2.2.2 降解菌的生长曲线

菌体在对数生长期分裂最旺盛，生理活性最强，处于对数生长期的微生物用于接种。如图4所示，该菌株在7h后进入对数生长期，18h后进入稳定期，32h后进入衰退期。

2.2.3 16SrDNA序列系统发育分析

将经酶切和PCR扩增验证得到的16SrDNA基因片段进行测序，并对测序结果进行相关分析。BLAST比对结果显示:ASAGd4与假单胞杆菌(Pseudomonas)的序列相似性很高。根据序列比对结果，利用MEGA 5软件构建了系统进化树(图5)。分析细菌16SrDNA的系统进化树，初步确定降解菌为假单胞杆菌属。

3 结论

以DON毒素为唯一碳源筛选毒素降解菌株，通过高效液相色谱方法检测降解菌对DON毒素的降解效果，最终获得对DON降解效率达56.61%的一株细菌，命名为ASAGd4。通过形态、生理生化特征分析和基于16SrDNA的系统发育聚类分析等，初步鉴定菌株ASAGd4为假单胞杆菌。