张来忠 孙长坡 吴子丹 伍松陵

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由禾谷镰刀菌、克地镰刀菌、黄色镰刀菌等多种镰刀霉菌产生的次级代谢产物。ZEN主要污染谷物及农副产品，是世界上污染范围最广的真菌毒素之一，具有类雌激素作用，会产生很强的生殖毒性以及致畸、致癌作用，会导致动物生殖障碍、内分泌系统紊乱。

目前，真菌毒素的去毒方法从原理上可分为脱毒和解毒，按方法手段可分为物理、化学、生物方法三大类，其中，生物手段以其反应条件温和、解毒彻底无残留以及无二次污染等优点日益成为近年来科技界研究的热点。目前国内外有人已从霉菌、酵母菌、细菌等菌株中获得了降解ZEN的基因，利用现代分子生物学技术，将其导入基因工程菌，并实现高效表达，应用于需要消减ZEN的各个行业。

刘海燕等于2011年获得玉米赤霉烯酮降解酶基因ZLHY6，并实现了在毕赤酵母中的高效表达。但由于使用的培养基成本较高，不适合工业化生产。本试验以筛选得到的活性强并导入玉米赤霉烯酮降解酶基因的重组毕赤酵母ZLHY6为出发菌株，通过响应面法优化试验，对毕赤酵母的基础生长培养基进行优化，以得到培养基成分的最优配比，为降低生产成本，简化培养基繁琐的配制过程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

ECOTRON型恒温摇床:瑞士INFORS公司;EVOLUTION 300全波长分光光度计:Thermo公司;WH220型加热磁力搅拌器:荣华科学仪器有限公司。

1.1.2 主要试剂

甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钙、蛋白胨、葡萄糖、酵母提取物均为国产试剂，购于西陇化工股份有限公司。

1.1.3 试验菌株

导入玉米赤霉烯酮降解酶基因的重组毕赤酵母ZLHY6由本实验室构建并保存。

1.2 方法

1.2.1 毕赤酵母ZLHY6生长曲线测定

种子液制备:从新鲜平板上挑取ZLHY6单菌落，接种于含有50μL G418的5 mL酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(简称YPD)试管中，于30℃、220r/min培养约18h作为种子液。按1%接种量将种子液接种于100mL BMGY培养基中，于30℃、220r/min培养，生长初期和末期取样间隔8h，中间阶段取样间隔4h，将菌悬液作适当稀释，用分光光度计于600nm下测定发酵液OD值，绘制生长曲线图。

将不同取样时间的样品8000r/min离心5min，取上述无菌BMGY培养基作为对照，测OD₆₀₀值。

1.2.2 利用Plackett－Burman法筛选影响毕赤酵母生长的重要因素

Plackett－Burman试验设计简称PB设计，是一种基于非完全平衡块原理、近饱和的两水平试验设计方法，该方法能以最少的试验次数估计考察因素的主效应。PB试验设计与正交试验设计相似，能从数量众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，以便于进一步研究。查阅毕赤酵母发酵相关文献，参考其中的生长培养基成分及其含量，确定了影响菌体生长的各个培养基成分(碳源:甘油，氮源:硫酸铵，缓冲体系:磷酸钾缓冲液，生长因子:酵母提取物，无机盐:硫酸镁、硫酸钙)。根据各因素对菌体密度的显著性影响确定最适试验中心点。

试验设计中优化培养基配制:先称取一定量的酵母提取物溶解于相应体积的10%甘油中，补充一定体积的去离子水至所需体系，搅拌均匀使其完全溶解后，称取对应量的硫酸铵、硫酸镁、硫酸钙溶解完全后，121℃灭菌30min，冷却后置于室温备用。

1.2.3 响应面分析法

根据各因素对菌体密度的显著性影响找到实验中心点后，采用Box－Behnken试验设计，每个因素在中心点上下适当范围再取两个水平，分别编码为－1、0、+1，利用3因素，N=15次的Box－Behnken实验设计各个实验组，以菌体密度OD₆₀₀为响应值Y进行实验。使用Design－expert进行响应面试验设计和分析。

1.2.4 模型验证实验

根据Design－expert进行岭脊分析后，得到各显著影响因素的各成分的预测比例，据此配制相应的培养基，接种毕赤酵母ZLHY6，30℃、220r/min培养一定时间后，取样测定发酵液OD₆₀₀值。

2 结果与分析

2.1 毕赤酵母ZLHY6生长曲线

在经过一段时间的适应期后，菌体开始快速生长，随着培养时间的推移，菌体密度不断增加，但是菌体密度上升到一定程度后，由于有害代谢产物的积累以及营养物质由消耗而致的不足，菌体逐渐趋于老龄化。由图1可以看出，毕赤酵母ZLHY6菌体在经过18h的缓慢生长后，在培养约24h时开始进入对数生长期，再经过大约2d生长后，菌体密度达到最高。故考察培养基对菌体密度的影响，可选择在培养约72h的菌体密度作为考察值。

2.2 Plackett－Burman法筛选影响毕赤酵母生长的重要因素

参考微生物生长所需重要因素的一般规律和毕赤酵母生长所需营养成分，同时结合相关文献报道的培养基成分、配比以及前期试验结果，选用N=12的PB试验设计，选取了甘油(X₁)、酵母提取物(X₂)、pH6.0的磷酸钾缓冲液(X₃)、硫酸铵(X₄)、硫酸镁(X₅)、硫酸钙(X₆)6个因素，考察它们对菌体生长的影响。每个因素选取高低两个水平，高水平约为低水平的1.25倍，响应值为菌体生物量OD₆₀₀(Y)。30℃、220r/min培养3d后，取样测定各试验组OD₆₀₀值。试验设计与结果见表1，结果分析见表2。

从表2可以看出，甘油、硫酸钙、酵母提取物这3个因素对菌体密度的影响最大，所以取甘油、硫酸钙、酵母提取物这3个因素进一步做响应面法优化试验，以确定最优培养基成分配比，而其他的3个因素取值，则根据其为正负效应因素和效应大小，正效应因素取高水平值，负效应因素取低水平值。

由于甘油为负效应因素，其含量应减少;酵母提取物、硫酸钙为正效应因素，应增加其含量，其余因素，磷酸钾缓冲液因为负效应因素故取较低水平值，硫酸铵和硫酸镁为正效应因素故取较高水平值，即10%的磷酸钾缓冲液、1.25%的硫酸铵、0.45%的硫酸镁。依据各因素效应大小的比例关系，重新设计试验，考察毕赤酵母菌体密度OD₆₀₀的变化趋势以确定试验设计中心点，结果见表3。

从表3可以看出最优培养基成分配比在第3组试验组合附近出现，因此以第3组各个因素水平为响应面的试验设计的中心点，即甘油3.0%、酵母提取物0.6%、硫酸钙0.04%。

2.3 响应面分析确定最大响应值

综合PB试验确定对响应值菌体密度影响显著的因素以及试验中心点，同时依据中心组合试验设计原理的Box－Behnke试验设计，进行3因素3水平的响应面分析试验，中心点重复3次，用重复3次的零点试验来估计试验误差。试验设计的因素及水平见表4，试验设计及结果见表5。

使用Design－expert8.0软件，对Box－Behnke试验得到的试验数据，进行方差分析和二次多元回归拟合，得到二次多元回归方程为Y=58.86+4.95X₁+1.93X₂+0.37X₆+1.45X₁X₂+0.42X₁X₆+1.14X₂X₆－2.57X₁²－0.21X₂²－2.06X₆²。方差分析结果见表6。

各个变量对响应值影响的显著性由各个变量的F检验来判定，其概率P的值越小，则对应变量的显著程度越高，从方差分析中可以看出，一次项X₁对回归模型的影响达到极显著的水平，同时一次项X₂、交互项X₁X₂、二次项X₁²、二次项X₆²对回归模型的响应值有显著影响。

由模型P=0.002＜0.05，可知该回归模型显著，而失拟项不显著(P=0.8801＞0.05)，表明得到的数据中没有异常点。该模型的相关系数的平方R²=0.9737，表明该回归方程的拟合度良好，表示响应值的97.37%的变异分布在回归方程的9个自变量中，总变异中仅有2.63%不能由该回归模型来解释，该回归模型能较好地反应各因素与响应值间的真实关系，可以利用得到的二次多元回归方程确定最佳培养基配比条件，以达到较高的菌体密度。

依据得到的回归方程，利用Design－expert8.0软件作出响应面分析图。如图2所示，X₁X₂和X₂X₆之间的交互作用比较明显，即甘油与酵母提取物之间、酵母提取物与硫酸钙之间存在重要的交互作用。

利用软件作进一步的岭脊分析，预测得到毕赤酵母ZLHY6菌体生长液体发酵培养基的最佳配方为3.5%甘油、0.65%酵母提取物、0.04%硫酸钙，预测培养3d后的菌体密度OD₆₀₀为64.57。

2.4 模型验证试验

为了验证模型的可靠性，在预测的最佳培养基配方条件下即3.5%甘油、0.65%酵母提取物、10%磷酸钾缓冲液、1.25%硫酸铵、0.45%硫酸镁、0.04%硫酸钙，进行了2次平行验证试验，测定OD₆₀₀为62.36、62.56，与预测值64.57接近，如图3所示。说明该模型能较好地预测毕赤酵母ZLHY6的实际生长情况。

3 结论

1)毕赤酵母ZLHY6在约24h进入对数生长期，菌体大量繁殖，在约72h菌体密度达到最高值，此后菌体生长进入稳定期，故在72h将酵母转入诱导培养基，可满足高密度发酵的要求。

2)通过PB试验以及响应面试验优化，得到一种经济、适合毕赤酵母ZLHY6生长、配制过程简单的培养基，培养配方为3.5%甘油、0.65%酵母提取物、10%磷酸钾缓冲液、1.25%硫酸铵、0.45%硫酸镁、0.04%硫酸钙。