王瑛瑶 栾霞 陈翔 魏翠平

脂肪酶( EC3.1.1.3)在非水相催化反应中具有高度的立体选择性和区域选择性，其在非水介质中的应用是当前国际研究热点。在食品、医药、饲料领域，利用脂肪酶酶催化改性天然脂类生产具有特定物化性质、营养功能和应用特性的结构脂质产品以满足不同应用需要，是脂肪酶非水相酶催化反应研究的重点内容。

菜籽油是我国优势油料资源，年均消费量约430万吨，占植物油消费总量的20%。菜籽油富含油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸。油酸是公认的功能性脂肪酸，具有降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL)，升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL)，预防动脉硬化，维持脑细胞膜结构，减少记忆力衰退，防止血栓形成等功效。本试验在前期研究基础上，以菜籽油和中碳链脂肪酸(辛酸)为反应底物，酶催化制备富含油酸和辛酸的结构脂质，合成的结构脂质产物中辛酸主要位于甘油骨架Sn-1,3位，而油酸主要位于甘油骨架Sn-2位。该结构脂质具有传统油脂物理特性和使用功能，而且最大限度的发挥了油酸功效，又具有供能速度快、降血脂和减少脂肪在体内堆积的功效，是一种可替代传统油脂使用的健康油脂。

国内外有学者对菜籽油与辛酸反应体系做了研究报道，万银松等研究认为在菜籽油酶法改性中，反应温度70℃、辛酸/菜籽油物质的量比2:1、加酶量12%、反应时间10h，辛酸合成率(质量百分比)约为15%。徐学兵等用脂肪酶催化辛酸与菜籽油反应，产物的辛酸质量分数为40.1%。本试验采用Box-behnken设计系统研究了菜籽油与辛酸酶催化工艺中反应参数对产物中辛酸合成率的影响，并对产品常规物化指标及热焓性质进行了分析。旨在充分掌握酶催化反应中反应参数及交互作用对辛酸合成率的影响及产物特性，为菜籽油改性工艺的实际应用提供参数选择依据，为产物在不同领域的应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菜籽油、辛酸:市购；脂肪酸标样:Sigma-Aldrich公司；脂肪酶:诺维信公司；甲醇(色谱纯)、乙腈:默克公司。

ACQUITYTM UPLC超高效液相色谱仪(配PDA检测器):美国Waters公司；SHZ－88台式水浴恒温振荡器、低速离心机:常州国华电器有限公司；旋转蒸发仪:瑞士BUCHI公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶催化合成反应及产物分离

在50mL磨口带塞圆底烧瓶中加入一定比例的菜籽油、辛酸和脂肪酶，旋紧塞子并混匀，置于恒温振荡水浴摇床上反应一定时间后，离心分离去除其中的脂肪酶，得到混合反应产物。

取3.0g混合反应产物溶于15mL正己烷中，加10mL0.8mol/L的KOH-乙醇水溶液(30:70)及几滴酚酞指示剂，剧烈摇晃，静置分离出正己烷层，用无水硫酸钠去除水后，除去有机溶剂，得到结构脂质。

1.2.2 辛酸合成率的检测方法

结构脂质样品经过皂化及衍生化反应，用超高效液相色谱仪分析反应产物中辛酸摩尔含量，以辛酸含量占三酰甘油中总脂肪酸含量的摩尔百分比定义为辛酸合成率，内标法定量。

1.2.3 结构脂质与油脂常规指标测定

酸值的测定，参照GB/T 5530—1985；皂化值的测定，参照GB/T 5534—2008；碘值的测定，参照GB/T 5532—2008；过氧化值的测定，参照GB/T 5538—2005；折光指数的测定，参照GB/T 5527—1985。油脂DSC热分析，参照AOCS Official Method Cj 1-94。

1.2.4 试验设计

在Box-behnken设计中，采用四因素三水平中心组合试验，以酶添加量、底物比、酸解时间及酸解温度为自变量，辛酸合成率为响应值，试验因素水平编码值见表1，共29个试验点，其中24个为析因试验点，5个中心试验点，试验结果采用Design Expert(Version 7..2) 软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 催化酸解工艺条件的优化

酶催化酸解反应中，影响合成率的因素有反应体系中水分添加量、酶添加量、底物比、酸解温度和酸解时间等。前期研究结果表明，本研究体系中，直接影响辛酸合成率的因素有酶添加量、底物比、反应时间和反应温度。为了更好的预测不同因素条件下辛酸合成率水平，设计了4因素3水平中心组合试验，依据试验结果得到回归模型，以便根据需要选择反应条件，得到预期的辛酸合成率。4因素3水平中心组合试验试验结果见表2。以辛酸合成率为响应指标，应用Design Expert软件对表2进行多元回归拟合，获得辛酸合成率(Y)对编码自变量酶添加量(A)、底物比(B)、酸解时间(C)、酸解温度(D)二次多项回归方程：

回归诊断表明，方程的决定系数(R²)为0.9940，信噪比为45.869，变异系数仅为0.72%。这说明方程的拟合度和可信度均很高，可以用于预测辛酸合成率。图1结果也表明，模型的预测值与实际试验值线性较好，该模型可以很好的用于预测不同变量水平下的辛酸合成率。

回归模型方差分析(表3与表4)表明，所建立的回归模型极显著(P<0.0001)；模型的一次项A、B、C、D对辛酸合成率的线性效应高度显著(“Pr>F”值小于0.0050)，对辛酸合成率影响重要性大小排序为底物摩尔比，酶量，反应时间，反应温度；二次项A²、B²和D²对辛酸合成率的曲面效应高度显著；交互项AB、AC、BC和BD交互效应显著(“Pr>F”值小于0.0500)，其他交互项不显著；表明各影响因素对辛酸合成率的影响不是简单的线性关系。

响应面图形是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上形象的看出最佳参数及各参数之间的相互作用。根据回归方程作出不同因子的响应分析立体图(见图 2)，随单个因素的增加辛酸合成率呈增大的趋势，两因素间的交互作用对辛酸合成率也具有相似的趋势。酶催化反应实际应用时，酶用量过大会增加生产成本；高的底物比率可能导致底物抑制和酶饱和效应的发生，同时由于体系中过多游离脂肪酸，给分离纯化带来困难；酶催化温度是导致酰基转移的主要因素，从而影响产物中辛酸在甘油骨架上的分布；反应时间的长短直接影响酶催化工艺的效率。因此，实际应用中，在满足辛酸合成率条件下，可以选择酶用量相对少、底物比相对小、反应时间相对短、温度相对低的反应条件。

在本试验条件范围内，运用模型的优化预测得知:酶添加量11.34%，底物比1∶5，反应时间23.32h，反应温度65℃时，辛酸合成率最大理论值为55.23%。采用上述工艺条件进行验证试验(鉴于实际可操作性，将参数修正为:酶添加量11%，底物比1:5，酸解时间23h，酸解温度65℃)，3次试验得到的实际辛酸合成率平均为(53.03±2.13)%，与理论预测值的相对误差为3.98%，表明采用响应面分析法优化得到的合成工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。In-Hwan Kim等对不同体系Lipozyme催化紫苏油与辛酸合成结构脂质进行了研究，结果表明正己烷体系中辛酸合成率为48.5%，无溶剂体系中仅为34．2%。国内报道菜籽油酶法改性的研究中辛酸合成率仅为30%左右。通过Box-behnken设计得到的反应参数及辛酸合成率具有较大的优势。

2.2 目标物的性质

基于油脂代谢中Sn-2位无论何种类型脂肪酸吸收率高的特点，研究开发集长碳链脂肪酸(LCFA)和中碳链脂肪酸(MCFA)两者优点的产品，获得将具有特定功能的LCFA结合到Sn-2位，MCFA结合到1，3-位的MLM型脂质，发挥其特殊营养价值和生理功能是本研究的出发点。菜籽油改性前后脂肪酸组成与分布见表5，可知当结构脂质辛酸合成率为45.1%时，油酸摩尔分数36.7%，1,3-位中辛酸摩尔分数达到60.1%，Sn-2位不饱和脂肪酸质量分数仍达80%，主要为油酸、亚油酸，其中油酸摩尔分数为55.8%。皂化值的大小主要取决于三酰甘油中脂肪酸相对分子质量，由于辛酸成功合成到原料油脂的甘油骨架上，改性后皂化值由192.73升高到242.7。结构脂质的碘值较原料油脂下降了26.46，酸值与过氧化值分别为0.1176mg KOH/g和0.297mmol/kg(见表6)。

DSC分析结果如图3所示，改性前后油脂吸热峰峰形发生显著变化。菜籽油起始熔化温度为-31.5℃，到-4.8℃时完全熔化，其间有两个峰，对应熔化温度分别为－15.8℃和－11.4℃，表明菜籽油中存在两种晶型。结构脂质热分析曲线峰形简单，仅有一种晶型，起始熔化温度与菜籽油基本相同，完全熔化温度下降到-15.3℃，峰对应温度为-21.4℃。油脂热熔性与三酰甘油中脂肪酸碳链的长短及饱和度密切相关，文中结构脂质热熔性的变化，正是由于辛酸成功合成到菜籽油中，使甘油酯中脂肪酸组成和位置分布发生改变而引起。

3 结论

3.1 通过Box－behnken设计对酶催化合成结构脂质工艺参数进行了优化，模拟得到可以用于预测辛酸合成率与反应参数的多项式回归方程。4个因素对辛酸合成率影响重要性排序为底物比>酶添加量>酸解时间>酸解温度。

3.2在本试验条件范围内，运用模型的优化预测得知:酶添加量11.34%，底物比1:5，反应时间23.32h，反应温度65℃时，辛酸合成率最大理论值为55.23%，实际试验结果为53.03%。