潘向昆 王瑛瑶 刘建学 段章群栾霞

近来，随着结构脂质营养学功能的不断被接受和认知，不同类型结构脂质的开发及其制备工艺成为国内外油脂科技研究的重点与热点内容之一。制备狭义上结构脂质的原理包括酸解法、直接酯化法、酯交换法等几种，其中酸解法由于原料来源广泛，生产成本较低而被广泛研究使用。前期研究中，以菜籽油与中碳链脂肪酸为底物(酸解法)在，固定化脂肪酶催化下合成了富含中碳链脂肪酸的结构脂质，其中中碳链脂肪酸主要位于sn-1,3位，是以MLM型为主的结构脂质(指长碳链脂肪酸位于甘油骨架的sn-2位，中碳链脂肪酸位于sn-1,3位)。这类结构脂质与长碳链脂肪酸甘油三酯相比，有易被消化、吸收快、氧化快的特点。但在酸解制备中，使用了过量的中碳链脂肪酸以提高合成率，以及酶催化过程中，中碳链脂肪酸所置换下的长碳链脂肪酸使得酸解体系中存在大量的游离脂肪酸，因此从反应体系中回收结构脂质存在较大的难度。本文承接前期工艺，研究了KOH醇水溶液中和酶催化酸解体系中的游离脂肪酸，分离纯化得到MLM型结构脂质的方法，较为系统地分析了不同参数条件对MLM型结构脂质回收率及组成的影响。本研究有助于在实验室规模下，有效地分离得到结构脂质产物，从而更好地开展酸解制备结构脂质工艺的探索与产物性质的研究工作。

1 材料与方法

1.1 试验材料

富含MLM型结构脂质的反应产物，实验室自制；正己烷、异丙醇、乙酸乙酯、丙酮均为色谱纯；KOH、乙醇及其他试剂均为分析纯；硅胶板G。Agilent6890型气相色谱仪，Waterse2695型高效液相色谱仪，WatersAcouity型超高效液相色谱仪，BuchiR-215型旋转蒸发仪，低速离心机等。

1.2 试验方法

1.2.1 酶催化酸解反应体系分离纯化

取一定质量的富含MLM型结构脂质的反应产物，加入一定体积的正己烷以及KOH醇水溶液(KOH浓度0.7mol/L)剧烈振荡2min，静置5min。下层醇水溶液再加入一定体积的正己烷二次提取，剧烈振荡2min，静置。合并两次萃取所得上清液，旋转蒸发去除有机溶剂，所得样品(即为纯化的MLM型结构脂质)称重，冰箱保存用于后续分析。

1.2.2 结构脂质回收率测定方法

结构脂质回收率定义如下:

结构脂质回收率=分离纯化后甘油三酯质量/未分离纯化前酶催化酸解反应产物中甘油三酯质量×100%

式中，未分离纯化前酶催化酸解反应产物中甘油三酯质量测定过程:取一定质量样品，用正己烷溶解后取一定体积的溶液进行薄板层析(展开剂:正己烷-乙醚-甲酸，体积比为70∶30∶1)，薄板展开后取甘油三酯谱带，甲酯化后进气相色谱分析，以十九烷酸甲酯为内标，根据气相色谱分析结果计算样品中甘油三酯质量。

气相色谱条件:程序升温为初始柱温110℃，维持3min，然后以4℃/min的速度升温到260℃，维持25min；检测器温度260℃；进样口温度110℃；氮气流量0.8mL/min；氢气流量40mL/min；空气流量450mL/min。

1.2.3 结构脂质组成分析

1.2.3.1 结构脂质中甘油三酯含量测定

精密称取50mg去酸后的样品，用正己烷-异丙醇(体积比90∶10)混合液定容至5mL，取10μL进高效液相色谱分析。

液相色谱条件:LiChrosorbSi-60(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，柱温40℃，ELSD检测器，漂流管温度90℃，氮气压力275.79kPa。流动相:A为正己烷，B为正己烷-异丙醇-乙酸乙酯-10%的甲酸溶液(体积比80∶10∶10∶1)，流速2mL/min。

梯度洗脱程序见表1。

1.2.3.2 结构脂质中不同类型甘油三酯含量测定

取100mg去酸后的样品，用丙酮定容至5mL，取0.2μL进超高效液相色谱分析。

超高效液相色谱分析条件:BEHC18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相为丙酮－乙腈(体积比65∶35)；ELSD温度40℃；氮气压力2.1MPa，增益500。

2 结果与讨论

2.1 分离纯化正交试验

结构脂质的分离纯化是一个很重要的过程。本研究中，酶催化酸解反应制备结构脂质过程中使用了过量的中碳链脂肪酸。规模化去除这部分中碳链脂肪酸和生成的游离脂肪酸的方法是减压精馏或分馏，但上述方法需要一定的样品量且耗时长，不利于酶催化酸解过程参数优化阶段快速得到结构脂质样品，获悉样品性质。此外，上述方法由于高温影响，导致油脂酰基转移，造成目标产物的减少和非目标产物的增加，可能会干扰对酶催化酸解过程参数的选择。

实验室常用的去除酶催化酸解体系中过多酸的方法是用 KOH醇水溶液中和去酸，从而分离纯化结构脂质。有先加 KOH醇水溶液中和体系中游离脂肪酸，后加正己烷提取体系中甘油三酯的醇水溶液－有机溶剂去酸方法的报道。这一方法适合于体系中游离脂肪酸(质量约是甘油三酯的4倍)极大过量的情况，因此本文采用先加正己烷后加KOH醇水溶液法去除结构脂质反应产物中的游离脂肪酸。

采用KOH醇水溶液浓度为0.7mol/L，选取正己烷与反应产物体积(mL)质量(g)比(A)、KOH醇水溶液与反应产物体积(mL)质量(g)比(B)、醇水溶液中醇-水体积(mL)比(C)、二次提取中正己烷与反应产物体积(mL)质量(g)比(D)为考察因素，以结构脂质的回收率为指标，优化KOH醇水溶液分离纯化结构脂质的条件。因素水平见表2，正交试验结果见表3。

由表3可以看出，分离纯化结构脂质的影响因素依次为C＞A＞B＞D，即醇水溶液中醇－水体积比对纯化结果影响最大，其次是正己烷与反应产物体积质量比，影响较小的是二次提取中正己烷与反应产物体积质量比。醇水溶液中醇－水体积比对回收率影响原因在于其对分离极性不同的游离脂肪酸和甘油三酯有很大的作用，较优的醇－水比例使得水相能最大限度地保留被皂化的游离脂肪酸，从而达到较好的分离效果。正己烷的作用是提取其中的甘油酯组分，其用量对极性较弱的甘油三酯损失有一定的影响。正交试验结果表明，去酸试验较优的组合为C2A3B1D2，即醇水溶液中醇－水体积比为30∶70，正己烷与反应产物体积质量比为12∶1，KOH醇水溶液与反应产物体积质量比为8∶1，二次提取中正己烷与反应产物体积质量比为3∶1。在此条件下，结构脂质的回收率达到94.35%，结构脂质的酸值(KOH)为0.11mg/g。本试验所采用的方法结构脂质回收率较高，产物损失较少，方法简单而且能够快速纯化结构脂质，为实验室条件下研究结构脂质提供了便捷的方法。

2.2 MLM型结构脂质组成分析

酶催化酸解反应是在中碳链脂肪酸过量的条件下进行的，在酶催化酸解反应过程中除了生成不同类型(如MMM，MLM，LLM，LLL)的结构脂质以外，还会产生甘一酯、甘二酯等中间副产物。副产物的含量及不同类型的结构脂质直接影响目标产物的营养学功能和食用性能。因此，本文对甘油三酯含量以及结构脂质的类型进行分析，对正交试验中产物进行测定，结果见表4，表5。

表4、表5结果表明，采用KOH醇水溶液分离纯化去酸条件对反应产物中甘油三酯含量的影响不太明显，对产物中MLM型结构脂质的影响更小。分析正交试验较优组合条件下得到的结构脂质，其甘油三酯含量为95.27%；MMM型结构脂质含量为1.19%，MLM型结构脂质含量为42.28%，LLM型结构脂质含量为49.49%，LLL型结构脂质含量为7.04%。结构脂质中甘油三酯含量与原料菜籽油(甘油三酯含量98.5%)相比，含量较低，而中间副产物的含量达到4.32%。其中的甘油二酯是酶催化酸解反应过程的中间产物，甘油一酯是甘油二酯和甘油三酯水解产生的副产物(在KOH醇水溶液去酸过程中碱性环境下使甘油三酯水解)。对于酶催化酸解制备特定结构脂质而言，期望MLL和MLM型结构脂质含量高且反应副产物甘油二酯等含量低。在反应过程中，反应温度、水分含量、反应时间等因素都会影响反应产物的组成，产物中MLM型结构脂质含量达到42.28%。曾有报道采用类似方法生产MLM型结构脂质，其含量为16.5%。采用本实验方法得到的目标产物MLM型结构脂质含量高于文献报道。

3 结论

KOH醇水溶液分离纯化MLM型结构脂质较佳条件为：KOH醇水溶液与反应产物体积(mL)质量(g)比8:1，醇水溶液中醇-水体积比30:70，正己烷与反应产物体积(mL)质量(g)比12:1，二次提取中正己烷与反应产物体积(mL)质量(g)比3:1，其中，醇水溶液中醇－水体积比对纯化结果影响最大，其次是正己烷与反应产物体积质量比，影响较小的是二次提取中正己烷与反应产物体积质量比。

较优条件下纯化，结构脂质的回收率达到94.35%，结构脂质中甘油三酯含量为95.27%，其中MLM型结构脂质含量为42.28%，结构脂质的酸值(KOH)为0.11mg/g。