皇甫志鹏 薛雅琳 刘元法 张东

我国是芝麻种植和消费大国，芝麻的产量和单产均居于世界首位。芝麻油因其浓郁而独特的气味、滋味和良好的口感，深受我国消费者的青睐，同时由于芝麻油市场售价很高，所以有不法商贩将其他廉价油脂掺入芝麻油中，不仅严重损害了消费者的利益，而且影响了芝麻、芝麻油产业的长远发展。为了保护消费者、诚信生产经营者的利益和芝麻油产业的长远发展，迫切需要建立科学、准确、适用广泛的油脂掺混分析检测体系。

国内针对芝麻油的掺混做了大量的工作，主要集中在掺混油脂与纯芝麻油脂肪酸组成的测定，此方法对大豆油和菜籽油掺入的检验有一定的效果，但是对葵花籽油掺入的检验效果较差。

油脂中的甘三酯立体结构对油脂的性质影响很大。近年来，国外亦针对橄榄油掺混的检验做了大量的工作，较有成效的研究则集中在对橄榄油甘三酯指纹图谱的测定，当其他油脂以3%～10%的比例掺入橄榄油时，通过比对甘三酯指纹图谱相似度，即可作出是否为掺混油脂的准确判定。试验对甘三酯指纹图谱相似度在芝麻油掺混中的应用展开研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

芝麻、芝麻油、大豆油、葵花籽油、玉米油、花生油:市售。

1.2 主要仪器、试剂

2695高效液相色谱仪(配有二元溶剂管理器、样品管理器、柱温箱、2424ELSD检测器、Empower数据处理系统):Waters公司;Agilent1260－Agilent6510Q－TOF液质联用系统:Agilent公司;丙酮、乙腈、异丙醇、己烷:色谱纯，FisherScienctific公司;MTBE(甲基叔丁基醚):色谱纯，Dikma公司。

1.3   试验方法

1.3.1 样品的制备

纯芝麻油:将芝麻油样品溶于己烷(色谱纯)，配制成10mg/mL的己烷溶液，过0.45μm聚四氟乙烯滤膜后用于甘三酯分析。

掺混油脂:将其他油脂以一定的比例混入芝麻油中，将掺混的样品在振荡器中震荡60s，然后用手上下剧烈震荡20s，再在振荡器中震荡60s，后溶于己烷(色谱纯)，配制成10mg/mL的己烷溶液，震荡30s，过0.45μm聚四氟乙烯滤膜后用于甘三酯分析。

1.3.2 HPLC－ELSD分析甘三酯

色谱条件:色谱柱:WatersSymmetry300TMC18(4.6mm×250mm，5μm);柱温:45℃;流动相:A:乙腈，B:异丙醇∶MTBE=8∶2;流速1.2mL/min;检测器:漂移管温度80℃，N2压力30psi，增益135。

1.3.3 甘三酯定性、定量分析

1.3.3.1 定性分析

将混合油脂样品进行HPLC－APCI－MS定性分析，通过出峰顺序及峰形的比对，确定相同液相条件下的甘三酯组分。

采用大气压化学电离(APCI)离子源和四级杆飞行时间(Q－TOF)质量检测器，根据甘三酯在质谱中断裂的规律可对甘三酯分子做出准确的定性分析。

质谱条件:采集模式:APCI+，采集范围:100～1000amu;干燥气温度350℃，干燥气流速10L/min，气化温度400℃;电晕电流4μA。

1.3.3.2 定量分析

采用面积归一化法，以HPLC－ELSD图谱中甘三酯峰面积百分比(%)作为相应种类甘三酯含量。    

1.3.4 试验精密度

将纯芝麻油或掺混油脂按1.3.1的样品制备方法制备样品，独立进样5次，测定各甘三酯组分的百分比，以验证方法的重复性，试验精密度以各组分的

RSD值表示。

1.4   芝麻油掺混的检验

利用甘三酯指纹图谱相似度检验芝麻油掺混，具体做法:测定纯品芝麻油的甘三酯组成(本试验中共33个芝麻油样品)，建立芝麻油甘三酯数据库;配制不同浓度梯度的掺混芝麻油，测定掺混芝麻油的甘三酯组成;根据实际情况，确定掺混油脂各甘三酯组分的权重;利用加权向量夹角余弦法计算掺混芝麻油甘三酯组成与纯品芝麻油甘三酯组成的相似度;用所得的系列相似度值作出芝麻油掺混各种植物油的拟合曲线或求出拟合公式。

2 结果与讨论

2.1 HPLC－ELSD分析条件的选择与确定

根据AOCSOfficialMethodCe5c－93方法，甘三酯的分析采用乙腈和丙酮作为流动相，实际分析过程中，采用乙腈－丙酮作为流动相的分析时间较长，达到良好的分离效果需要45～55min，且丙酮属于易制毒溶剂并具有较大的毒性，故考虑用其他溶剂代替，经过初期的探索，最终确定以异丙醇∶MTBE(甲基叔丁基醚)=8∶2作为代替丙酮的流动相。

试验发现，采用1.0mL/min的流速时，分析时间较长，采用1.5mL/min的流速时，甘三酯分离效果不理想，采用1.2mL/min的流速时，分离效果良好，且分析时间较短，故最终确定流速为1.2mL/min。在1.2mL/min流速下，将40、45、50℃3种柱温进行比对，发现40℃时，甘三酯峰形较宽，50℃时分离效果不理想，故确定采用45℃柱温。

首先以A∶B=3∶7进行等度洗脱，探索梯度条件，最终确定梯度，见表1。以上条件下，甘三酯分析时间短，分离度良好，芝麻油各甘三酯组分的分离效果如图1。由图1可见，芝麻油的主要甘三酯峰形和分离度良好，做到了基线分离，有利于甘三酯组分含量的测定。

2.2 HPLC－APCI－MS对甘三酯定性分析

质谱检测器具有非常高灵敏度，对于分析甘三酯非常合适，它的优势在于能产生对分析结果有用的离子，如提供分子质量信息的分子离子、脂肪酰基离子及一些单酰基甘油离子和二酰基甘油离子等，根据这些离子特征可准确判断甘油酯类型、脂肪酸组成及其位置分布。甘三酯在APCI质谱中断裂形成碎片离子如图2所示。根据这些断裂规律，可对甘三酯组分做出准确的定性分析，分析结果见表2。

2.3 试验精密度

按1.3.4的方法进行纯芝麻油和混合油脂的精密度试验，独立进样5次，结果用甘三酯组分的质量分数(%)表示，结果如表3、表4。

由以上结果可知，甘三酯各组分含量的测定RSD值范围良好，均在液相色谱系统RSD值以下，试验方法稳定性良好，精密度高，适合基于甘三酯图谱相似度的油脂掺混检验工作的长期开展。

2.4   芝麻油掺混的检验

2.4.1 纯芝麻油甘三酯数据库的建立

按1.3.2的方法测定供试33个芝麻油样品的甘三酯组成，建立数据库，其组成范围如表5。

2.4.2 指纹图谱相似度的计算

当不同油脂以一定的梯度比例混入芝麻油时，其甘三酯组分的变化规律不尽相同，因此，在计算掺混油脂和纯芝麻油的指纹图谱相似度时，需要将不同的权重分配给甘三酯各个组分，具体的权重选取需满足以下原则：权重需结合实际情况应用层次分析法选取;相对变化率大的甘三酯组分权重大，反之亦然;变化明显的甘三酯组分的实际含量与权重的乘积应在同一数量级且乘积与甘三酯性对变化率的大小相符合。

指纹图谱的相似度的比对不能仅通过简单的含量比较，需引入加权向量夹角余弦的计算和比对方法，以掺混油脂和芝麻油数据库之间的加权向量夹角余弦值表示芝麻油指纹图谱的相似度，进行掺混油脂的检验，相似度的计算见公式(1)。

式中:Xi为某个样品对应保留时间下的峰面积或峰高;Yi为n批样品(n≥10)对应保留时间下的平均峰面积或峰高(对照指纹图谱)。

2.4.3 大豆－芝麻油的掺混检验

将大豆油按表6的比例掺入芝麻油，按1.3.11.3.2的方法制备、分析样品，其甘三酯组成见表5。

由表5可知，大豆油掺入芝麻油时，出现新的组分LLLn，定性效果明显，而LLL，PLL，OOO，SOL，SSL甘三酯组分相对变化率较大，且和芝麻油有较大差异，因此，这些组分的权重应较高，具体权重的分配如表7。

将甘三酯组分的含量与其权重相乘，得到加权甘三酯组成，并按公式1计算指纹图谱的相似度，结果如表8。

分析表7的数据可知，用于掺混试验的芝麻油和芝麻油数据库的相似度为0.996，这是因为芝麻油甘三酯数据库中各甘三酯组成有一定的波动范围，单一芝麻油样本和数据库的相似度很高，但不可能为1，这点与实际情况相符。当大豆油的掺入量达到3%时，其相似度大幅下降，能准确做出是否是掺混油脂的判定。

将指纹图谱相似度和掺入量进行回归运算，结果如图3所示。

拟合公式为Y=0.0354X3－0.1818X2+3.6313X－3.8667，R²=0.9973。

由以上试验可知，大豆－芝麻掺混油脂的指纹图谱和纯芝麻油有明显的差别，即使是少量(3%)的大豆油掺入芝麻油时，其指纹图谱相似度也和纯芝麻油有较大的差距。大豆－芝麻油指纹图谱相似度与掺入量的拟合曲线的R2=0.9973，拟合曲线准确可靠，此方法适用于大豆－芝麻油的掺混检验。

2.4.4 葵花籽－芝麻油的掺混检验

将葵花籽油按表8的比例掺入芝麻油，按1.3.1和1.3.2的方法制备、分析样品，其甘三酯组成如表9。

由表9可知，葵花籽油掺入芝麻油时，LLL，OOO，SOL，POO等甘三酯组分相对变化率较大，且和芝麻油有差异，因此，这些组分的权重应较高，具体权重的分配如表10。

将甘三酯组分的含量与其权重相乘，得到加权甘三酯组成，并按公式1计算指纹图谱的相似度，结果如表11。

由表11可知，当芝麻油中葵花籽油的掺入量达到3%时，其指纹图谱相似度为0.906，掺混检验效果与大豆－芝麻油相比较差，但仍能做出掺混油脂的准确判定。

将指纹图谱相似度和掺入量进行回归运算，结果如图4所示。

拟合公式为Y=0.4015X2+0.9409X－0.8333，R²=0.9958

由以上试验可知，葵花籽油－芝麻掺混油脂的指纹图谱和纯芝麻油有明显的差别，即使是少量(3%)的葵花籽油油掺入芝麻油时，其指纹图谱相似度也和纯芝麻油有较大的差距。大豆-芝麻油指纹图谱相似度与掺入量的拟合曲线的R²=0.9973，拟合曲线准确可靠，此方法适用于大豆-芝麻油的掺混检验。

3 结论

以HPLC－ELSD法采用合适的分离条件可以很好的分离油脂的甘三酯组分，应用HPLC－APCI－MS方法可以对甘三酯各组分做出准确的定性，从而获得油脂的甘三酯指纹图谱。

以纯芝麻油的甘三酯指纹图谱作为主要指标建立纯芝麻油的数据库，通过计算掺混芝麻油与纯芝麻油数据库的甘三酯指纹图谱相似度，可以很好的检验掺混芝麻油，试验表明，当大豆油，葵花籽油对芝麻油的掺入比例达到3%时，即可对掺混芝麻油做出准确的判定。