1　范围

本标准规定了采用气相色谱法以角鲨烷为内标测定植物油中角鲨烯含量的原理、试剂、仪器、试样的制备、操作步骤、结果表示及精密度等。

本标准适用于植物油中角鲨烯含量的测定。

本标准方法的检出限为5mg/kg。

2　规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法（GB/T 6682-2008，ISO3696：1987，MOD）

GB/T 15687 动植物油脂 试样的制备（GB/T 15687－2008,ISO 661:2003,IDT）

3　原理

样品经氢氧化钾-乙醇溶液皂化、正己烷提取后，采用气相色谱法，以角鲨烷为内标法测定植物油中角鲨烯的含量。

4　试剂

本标准所用水均为二级水，除特殊规定外，所用试剂均为分析纯。

4.1　氢氧化钾。

4.2　乙醇。

4.3　正己烷：色谱纯。

4.4　氢氧化钾-乙醇溶液（约1mol/L）：称取60g±0.1g氢氧化钾，加入50mL的水进行溶解，然后用95%乙醇稀释至1000mL，溶液应为无色或浅黄色。

4.5　10%乙醇溶液：用量筒量取50mL乙醇（4.2）于500mL容量瓶中，用水定容至刻度。

4.6　无水硫酸钠。

4.7　角鲨烷标准品：纯度≥98%。

4.8　角鲨烯标准品：纯度≥98%。

4.9　角鲨烷内标溶液：准确称取25mg（精确到到0.0001g）角鲨烷标准品（4.7）到25mL容量瓶内，加入少量正己烷（4.3），使其充分溶解，然后定容至刻度，摇匀，即配成1mg/mL的内标溶液标准，备用。

4.10　角鲨烯标准溶液：称取10mg（精确到到0.0001g）角鲨烯标准品（4.8）到25mL容量瓶内，加入少量正己烷（4.3），使其充分溶解，然后定容至刻度，摇匀，即配成400μg/mL的标准溶液，确认角鲨烯保留时间。

4.11　PH试纸:指示范围1～14。

5　仪器

5.1　气相色谱仪：配FID检测器。

5.2　涡旋振荡器。

5.3　分析天平：精度0.0001g。

5.4　旋转蒸发仪。

5.5　恒温水浴锅。

5.6　氮吹仪。

6　试样制备

按GB/T 15687执行。

7　操作步骤

7.1　样品处理

7.1.1 称量：准确移取300µL角鲨烷内标溶液（4.9）于250mL磨口烧瓶中，在氮吹仪上吹干后，准确称取0.2g~2g样品（精确到0.0001g）于此烧瓶中。

注1：角鲨烯含量较高的植物油（>800mg/kg），如橄榄油等称量0.2g，角鲨烯含量较低的植物油(<800mg/kg)，如大豆油等称量2g。如植物油中含有与内标角鲨烷相同保留时间的峰,则在角鲨烯测定时必须在加和不加内标物情况下重复分析。

7.1.2 皂化：加入50mL氢氧化钾-乙醇溶液（4.4），在80℃恒温水浴锅（5.5）中皂化回流50min，停止加热，从回流管顶部加入50mL水，取出烧瓶摇匀，立即冷却。

7.1.3 提取：将冷却至室温的皂化液转移至250mL分液漏斗中，用50mL正己烷（4.3）分三次洗涤烧瓶，洗涤液倒入分液漏斗中，用力摇动分液漏斗2min，倒转分液漏斗，并小心打开旋塞，间歇地释放压力，静置分层，将下层皂化液转移至另一个250mL分液漏斗中，再用相同的方法，分别用30mL、20mL正己烷（4.3）对皂化液再提取两次，将三次正己烷（4.3）提取液置于同一分液漏斗中。

7.1.4 洗涤：用25mL乙醇溶液（4.5）洗涤正己烷提取液三至四次，每次弃去下层的乙醇水溶液，用PH试纸（4.11）检验直至下层流出液呈中性。

注2：第一次用乙醇溶液洗涤时要轻摇，防止乳化，逐次振摇强度可增加。如出现乳化层，可喷淋少量的无水乙醇。

7.1.5 浓缩：将洗至中性的正己烷提取液经过约5g的无水硫酸钠（4.6）滤入与旋转蒸发仪（5.4）配套的球形蒸发瓶中，再用约20mL的正己烷冲洗分液漏斗及无水硫酸钠三次，并入蒸发瓶中，在40℃水浴中旋转蒸发溶剂，待瓶中剩下约2mL正己烷时，取下蒸发瓶，立即放入氮吹仪（5.6）中吹干，最后用正己烷（4.3）溶解并定容至10mL，待测。

7.2　色谱参考条件

气相色谱柱：HP-5毛细管柱，长30m，内径0.32mm，薄膜厚度0.25μm；

载气：高纯氮气( 纯度99.999% )，恒压：16psi，分流比1：10；

进样口温度：250℃；柱温采用程序升温方式，以15℃ /min的速率从160℃升温到220℃，保持2min，然后以5℃/min的速率升温到280℃，保持20 min；最后以5℃/min的速率升温到300℃，保持2min。

FID检测器：温度300℃，氢气流速40mL/min，空气流速450mL/min，尾吹气流速30mL/min；

进样量：1.0μL。

也可采用其他等效的毛细管柱或色谱条件。

7.3　样品测定

    将样品待测溶液注入气相色谱仪中进行分析，记录样品中角鲨烯和角鲨烷峰面积。根据样品的角鲨烯和内标角鲨烷峰面积之比及加入样品的内标质量，计算出待测样品中角鲨烯的质量。

8　结果表示

样品中角鲨烯的含量（X）按式（1）计算：

式中：

X—样品中角鲨烯的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

A₁—样品中角鲨烯的峰面积；

A_S—样品中内标角鲨烷的峰面积；

m_S—样品中加入的内标角鲨烷的质量，单位为微克（μg）；

m—样品质量，单位为克（g）。

结果保留小数点后两位。

注：在给定的条件下，用氢火焰离子化检测器检测等量的角鲨烯和角鲨烷时可获得相同的响应值，因此，角鲨烯和角鲨烷的校正因子为1。

9　精密度

9.1　重复性

在重复条件下获得的两个独立测试结果的绝对差小于等于重复性限（r）的情况应大于95%。角鲨烯含量的重复性限（r）参见附录A。

9.2　再现性

在再现性条件下获得的两个独立测试结果的绝对差小于等于再现性限（R）的情况应大于95%。角鲨烯含量的再现性限（R）参见附录A。

附录A

（资料性附录）

实验室间测试结果

表A.1给出了多家实验室采用气相色谱法内标测定植物油中角鲨烯含量的结果，测试实验由国家粮食局科学研究院组织，测试结果按GB/T 6379.1(ISO 5725-1:1994,IDT)和GB/T 6379.2 (ISO 5725-2:1994,IDT)进行统计分析，其数据见表A.1。

附录B

（资料性附录）

角鲨烯和内标角鲨烷标准色谱图