1  范围

本标准规定了用于动植物油脂甘三酯分子2-脂肪酸（β或内位）组分的测定。

由于胰脂酶的活性，这个方法只适用于熔点在45℃以下的油脂。

这个方法不适合含有下列物质的油脂：

——含有十二或更少碳原子（如：椰子油、棕榈仁油、黄油）的脂肪酸；

——含有二十碳或更多碳原子（鱼油和海生动物油）的高度不饱和脂肪酸（多于四个双键）；

——含有氧化次基团。

2  规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 5524  植物油脂检验 扦样、分样法

GB/T 5530  动植物油脂 酸价和酸度测定

GB/T 6682   分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 15687  油脂试样制备

GB/T 17376  动植物油脂 脂肪酸甲酯制备

GB/T 17377  动植物油脂 脂肪酸甲酯的气相色谱分析

3  原理

在中和游离脂肪酸后，用柱色谱净化试样。甘三酯被酶部分水解生成2-单甘酯。用薄层色谱（TLC）分离2-单甘酯，并用气相色谱分析脂肪酸组分。

4  试剂

所有试剂均为分析级。

4.1  用于试样净化的试剂

4.1.1  2-丙醇，95%（V/V），或乙醇，95%（V/V）。

4.1.2  正己烷或石油醚，沸点范围：30℃至60℃。

4.1.3  2-丙醇，50%（V/V），或乙醇，50%（V/V）。

4.1.4  氢氧化钠，0.5mol/L溶液。

4.1.5  酚酞溶液，每100mL95%(V/V)乙醇溶液加入1g酚酞。

4.1.6  中性活化氧化铝，用于柱色谱。

4.1.7  氮气。

4.2  用于甘三酯水解的试剂

4.2.1  乙醚。

4.2.2  盐酸，6mol/L。

4.2.3  胆烷酸钠，1g/L溶液，提高酶催化质量。

4.2.4  氯化钙，220g/L水溶液。

4.2.5  缓冲溶液，1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液。用盐酸调节pH值到8，并用pH计测量。该溶液在0℃～4℃条件下贮存，并在14天内使用。

4.2.6  胰脂肪酶，活度范围在8～20单位/mg。储存在冰箱里。使用前，由于周围温度带有粉末。

4.3  用于分离2-单甘酯的试剂

4.3.1  乙醇，95%（V/V）。

4.3.2  正己烷或石油醚，沸点范围：30℃ ～60℃。

4.3.3  丙酮。

4.3.4  硅胶土，带包装，用于薄层色谱。

4.3.5  展开剂，其中：正己烷或石油醚，70mL；乙醚，30mL；甲酸，98%（V/V），1mL。

4.3.6  2’，7’-二氯萤光黄溶液，显示剂，2g/L乙醇溶液。该溶液每100mL加入1滴1mol/L氢氧化钠溶液，使呈微碱性。

4.4  用气相色谱分析2-单甘酯的试剂

参见GB/T 17377 动植物油脂 脂肪酸甲酯的气相色谱分析和GB/T 17376 动植物油脂 脂肪酸甲酯制备。

5  仪器

常规和专用仪器如下：

5.1  用于净化样品的仪器 

5.1.1  水浴锅，能恒温控制，并保持温度在30℃ ～40℃之间。

5.1.2  层析柱，用于色谱分离，13mm×400mm玻璃柱，带有玻璃塞。

5.1.3  旋转蒸发器，带有250mL圆底烧瓶。

5.1.4  试管，规格5mL～410mL用于充入氮气。

5.1.5  分液漏斗，规格500mL。

5.1.6  圆底烧瓶，规格100mL。

5.2  用于甘三酯水解的仪器

5.2.1  离心机。

5.2.2  离心管，玻璃，规格10mL，带有磨口玻璃塞。

5.2.3  电动振荡器，能使离心管激烈摇动。

5.2.4  水浴锅，能恒温控制，并保持温度在40℃±0.5℃。

5.2.5  注射器，规格1mL，带有细针。

5.2.6  秒表。

5.3     用于分离2-单甘酯的仪器

5.3.1  展开槽，用于薄层色谱，带有磨砂玻璃盖，适合于200mm×200mm玻板。

5.3.2  涂布器，用于玻板上制备试样。

5.3.3  玻板，200mm×200mm。

5.3.4  微量调解注射器，剂量为3μL～4μL。

5.3.5  喷雾器，用于玻板上喷指示剂。

5.3.6  铲刮器，用于刮下单甘酯谱带。

5.3.7  烘箱，能保持温度在103℃±2℃。

5.3.8  紫外灯，用于检测色谱板，波长为254nm。

5.3.9  圆底烧瓶，规格25mL，配有1m长空气冷凝器和磨口接头。

5.3.10  锥形瓶，规格250mL，带有磨口玻璃塞。

5.3.11  锥形瓶，规格50mL。

5.3.12  过滤器，玻璃，40孔（16μm～40μm）。

5.3.13  干燥器，带有效干燥剂。

5.4     用气相色谱法分析2-单甘酯的仪器

参见GB/T 17377 动植物油脂 脂肪酸甲酯的气相色谱分析和GB/T 17376  动植物油脂 脂肪酸甲酯制备。

6  取样及试样制备

实验室接受样品必须真实且具有代表性，在运输和贮存期间不能损坏和改变。

按GB/T 5524 规定的方法扦样、分样。

按GB/T 15687 规定的方法制备试样。

7  分析步骤

7.1  试样酸值的测定 

试样酸值测定方法根据GB/T 5530 动植物油脂 酸价和酸度测定。如果样品酸值低于3%（m/m），可直接通过氧化铝色谱柱净化试样；如果酸值高于3%（m/m）,可首先在有溶剂存在的情况下用氢氧化钠中和，然后通过氧化铝色谱柱净化试样。

7.2  用氢氧化钠中和 

将约10g的毛油置于分液漏斗中，加入100mL正己烷或石油醚、50mL2-丙醇或乙醇、数滴酚酞溶液，加入中和油样游离酸值所需的氢氧化钠溶液，并加超0.5%量的氢氧化钠溶液。用力振摇1min，加入50mL蒸馏水再振摇，然后静置。分层后，弃去下层皂液和中间层（粘液和不溶于水的物质）。逐次用25mL～30mL的2-丙醇或乙醇溶液洗去中和油脂的正己烷或石油醚，直至酚酞的粉红色消失。

将溶液转移到旋转蒸发器的底瓶中，在减压条件下用蒸馏方法去除掉大部分正己烷或石油醚。在减压并充入氮气流、温度为30℃～40℃条件下，干燥油脂，直到溶剂完全除去为止。

7.3  通过氧化铝色谱柱净化样品 

制备15g活性氧化铝在50mL正己烷或石油醚的悬浮液，边搅拌边倒入色谱柱中，使氧化铝均匀沉降，使溶剂液面降至吸收剂以上1mm～2mm以内。用25mL正己烷或石油醚溶解5g油脂，并小心将溶液倒入色谱柱里，用100mL圆底烧瓶收集从色谱柱流出的洗涤液。

在减压条件下，用蒸馏方法去除溶剂， 在30℃～40℃温度下干燥油脂，并充入氮气流，直到溶剂完全除去为止。

7.4  甘三酯水解

7.4.1  称取约0.1g制备样品置于10mL离心管中。在环境温度下，如果试样不是液体，将离心管置于60℃～65℃的水浴锅上。如果到那时试样还不完全是液体，继续加热，不超过10S。从水浴锅上移开离心管，迅速进行下列操作。

7.4.2  加入20mg脂肪酶及2mL缓冲溶液，小心振摇，然后加入0.5mL的胆烷酸钠和0.2mL氯化钙溶液。用磨口塞塞好管子，小心振摇，并将管子立即放入40℃水浴锅上，保持手摇60s±2s。

7.4.3  从水浴锅上移开离心管，并用振荡器激烈振摇120s。

7.4.4  立即加入1mL盐酸和1mL乙醚。用磨口塞塞好管子，并用振荡器激烈振摇。

7.4.5  离心分离，并用注射器将有机相移到试管里。如果在环境温度下试样是固体，继续用1mL乙醚浸取离心管的试样。

7.5  2-单甘酯的分析

7.5.1  薄层板的制备

用乙醇、正己烷或石油醚、丙酮小心清洗玻璃板，直到脂肪类物质彻底清除。称30g硅胶土装入250mL锥形瓶中，加入60mL水。盖上塞子，激烈摇动1min，立即将浆液倒入涂布器上，在干净的薄层板上涂上0.25mm厚的一层。接着在空气中干燥1h。通常情况下，不论是按上述方法制备的薄层板，还是购买的薄层板，为保持活性都需要在103℃的烘箱中烘1h。在干燥器中冷却到室温并保存到使用前。

反应混和物尽可能快用TLC分离。

7.5.2  2-单甘酯的分离

用微量调解注射器将浸出好的样品滴在距离制备好的薄层板底边缘15mm的地方，成一连续的直线。将薄层板立在展开箱里，展开箱事先备好展开剂。盖上盖子，直到溶剂到达距离薄层板上方边缘10mm处时取出。操作温度约20℃。在约20℃温度下，在空气中干燥薄层板，用喷雾器将显示剂喷涂在薄层板上。在紫外光下鉴别单甘酯的谱带（Rf值约0.035），并用铲刮器刮下，避免丢失残留在基线上的部分。将收集到的硅胶转移到甲酯化的烧瓶里，并按“脂肪酸甲酯的制备方法”甲酯化，按下列步骤用气相色谱法分析。

7.6  用气相色谱法分析2-单甘酯

通过处理收集到的硅胶（从硅胶中用浸出法提取单甘酯）获得的单甘酯直接按“脂肪酸甲酯的制备方法”甲酯化，用三氟化硼方法及相关的其他方法，继续按“脂肪酸甲酯气相色谱分析法”操作。

8  结果表示

计算2-脂肪酸酯的比例，用2-单甘酯占总脂肪酸酯的质量百分数表示。

结果保留一位小数。

9  精密度

9.1  重复性

在同一个实验室里，同一个操作者使用相同仪器对同一样品的测定结果绝对差：

脂肪酸酯含量 ＜5 %（m/m）时，绝对差＜0.2%（m/m）；

脂肪酸酯含量 ≥5 %（m/m）时，绝对差＜1%（m/m）。

9.2  再现性

脂肪酸酯含量 ＜5 %（m/m）时，绝对差＜0.5%（m/m）；

脂肪酸酯含量 ≥5 %（m/m）时，绝对差＜3 %（m/m）。

10  实验报告

实验报告应给出取样方法、测定方法、测定结果，检查重复性，保留的结果。本标准中未指定或自选的操作细节，以及可能影响结果的任何事件的细节。

试验报告包括所有完成这个样品测试的信息。

附  录  A

（规范性附录）

 脂肪酶的制备和活性的测定

A.1  脂肪酶的制备

A.1.1  将5kg的鲜猪胰脏冻至0℃，除去周围的固体脂肪和连着的组织，在捣碎机中捣碎，这样获得一糊状物。将此物搅拌4h～6h，加入2.5L无水丙酮，然后离心分离。

A.1.2  用同体积的丙酮萃取残留物三次以上，然后用1/1（V/V）的丙酮和乙醚混合液萃取两次，再用乙醚萃取两次。

A.1.3  在真空条件下将残留物干燥48h，获得一稳定的粉末，储存在4℃冰箱中备用。

A.2  脂肪酶活性的测定

A.2.1  在一适宜的搅拌装置中， 用165mL阿拉伯树胶溶液、15g碎冰和20mL中性油振荡混合10min，制备一种乳胶油。

A.2.2  取10mL乳胶油置于50mL烧杯中，依次加入0.3mL胆酸钠（200g/L）溶液和20mL蒸馏水。将烧杯置入温度维持在37±0.5℃的水浴锅中。

A.2.3  插入pH计的电极和螺旋形搅拌器，用5mL滴定管一滴一滴地加入0.1mol/L氢氧化钠溶液，直到pH值达到8.5。

A.2.4  加入足够的脂肪酶悬浮水溶液，刚加入，pH计显示出8.3的pH值，这时启动秒表，滴进0.1mol/L氢氧化钠溶液，使pH值维持在8.3，读出每分钟消耗碱溶液的体积数。注意每分钟使用的碱溶液体积，大约10min。

A.2.5  用时间读数作横坐标，以维持恒定pH值所需碱溶液的毫升数为纵坐标，用图象形式记录测定值，所得图象应为一直线。

注：使用液体油脂时，水解温度选定37℃。但是对这项试验，测定的脂肪熔点在45℃以下，所以试样可选定40℃进行水解。

这项试验的目的，用一定量的脂肪酶悬浮液使消耗1mL碱液约需4min～5min。这个结果一般需要2mL～5mL 脂肪酶悬浮液，也就是1mg～5mg的粉末。

规定在37℃和pH 8.3条件下，脂肪酶的单位为每分钟析出1umol酸所需酶的量。

活度A，用所用粉料的脂肪酶单位/mg表示，按下式计：

式中：

V—— 从图象中算出的每分钟消耗氢氧化钠溶液的体积数，单位为mL/min；

m—— 脂肪酶粉料试样的质量，单位为mg；

C——  氢氧化钠溶液浓度，单位为mmol/L(=100mmol/L)。

附  录  B

（资料性附录）

多个实验室的测定结果

B.1  使用填充柱的方法

多个实验室的测定由荷兰完成。有8个实验室对猪油、牛油、40%猪油和60%牛油的混合油样品进行测试，给出淘汰后统计结果（根据ISO5725^[2]评价）如下表B.1。结果用甲酯占质量百分数表示。

B.2  使用毛细管柱的方法

1993年，多个实验室用AOCS/IOOC方法对3个橄榄油样品测试，24个实验室参加。表B.2给出了统计结果（根据ISO5725^[2]评价）。结果是甘三酯分子2位上的C16：0和C18：0脂肪酸组分。