1 范围

本标准用来检测橄榄油中是否掺入的其它植物油。能检测出高亚油酸植物油（大豆油、菜籽油、葵花籽油等）和一些高油酸植物油（榛果油、高油酸葵花籽油和橄榄果渣油）。检出限取决于掺入油脂的种类及橄榄油品种。通常，掺入5%~15%榛果油能有效检测出。该方法不能检测出掺入油脂的种类，仅能证实橄榄油是否是真实橄榄油。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法

GB/T 15687 油脂试样制备

COI/T.20/Doc. no. 24 Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil

COI/T.20/Doc. no. 17 Determination of trans unsaturated fatty acids by capillary column gas chromatography

COI/T.20/Doc. no. 20 Determination of the difference between actual and theoretical content of triacylglycerols with ECN 42

3 原理

实验的甘油三酯组成与脂肪酸组成推论得到的甘油三酯组成进行比较。油脂经硅胶固相萃取小柱（SPE）纯化，反相高效液相色谱分离，示差折光检测器，乙腈丙酮为流动相测定甘油三酯组成。脂肪酸甲酯由纯化后的油经氢氧化钾甲醇溶液甲酯化制得，脂肪酸甲酯组成由气相色谱经经极性色谱柱测定方法。理论甘油三酯组成通过计算机程序设定甘油三酯三条链上，1,3位-随机与2位-随机分布，限定饱和脂肪酸位于2位。计算方法依据COI/T.20/Doc. no. 20改进后得到。数学计算程序依据实际测出及脂肪酸组成推测的甘油三酯组成计算，计算结果与真实橄榄油建立的数据库进行比较。

4 试剂

本标准所用水均为三级水，除特殊规定外，所用试剂均为分析纯。

4.1　油脂纯化

4.1.1　正己烷。

4.1.2　乙醚。

4.1.3　混合溶剂：正己烷/乙醚（87/13，v/v）。

4.1.4　丙酮。

4.2　HPLC分析甘油三酯组成

4.2.1　乙腈：丙酮（流动相，50:50），色谱级。

4.3　脂肪酸甲酯制备

4.3.1　甲醇（含水量小于0.5%），色谱级。

4.3.2　正庚烷，色谱级。

4.3.3　氢氧化钾。

4.3.4　2N KOH甲醇溶液：1.1g KOH溶于10ml甲醇。

5 仪器

5.1 固相萃取真空洗脱装置。

5.2 旋转蒸发仪。

5.3 HPLC组成：

5.3.1 脱气包；

5.3.2 10μL进样器；

5.3.3 压力泵装置；

5.3.4 箱温控制（15-20℃）；

5.3.5 示差折光检测器；

5.3.6 电脑采集系统；

5.3.7 150μL液相进样器；

5.3.8 液相色谱柱（25cm×4.6mm）RP-C18相（5μm粒径）。

5.4 气相色谱条件：

5.4.1 分流进样；

5.4.2 FID检测器；

5.4.3 柱温箱；

5.4.4 电脑采集系统；

5.4.5 毛细管气相色谱柱（50-60m×0.25-0.30mm i.d）氰丙基苯基聚硅氧烷涂层，涂层厚度0.20-0.25μm（SP-2380及同极性）；

5.4.6 5μL气相微量进样器。

5.5 EXCEL。

5.5.1 25ml锥形烧瓶。

5.5.2 5ml螺旋盖玻璃管及聚四氟乙烯盖子。

5.5.3 固相萃取硅胶小柱，1g(6ml)。

6 操作步骤

6.1 油脂纯化

SPE硅胶小柱（5.8）装入真空洗脱装置（5.1）上，真空条件下6ml正己烷（4.1.1）洗脱。释放真空以防止小柱流干，在SPE柱（5.8）下放置锥形瓶（5.6）。约0.12g油溶于0.5ml正己烷（4.1.1）中，上样，后采用10ml混合溶剂（4.1.3）洗脱。将洗脱溶液摇匀后等分为两份，两份溶液分别用旋转蒸发仪室温下旋蒸至干。用于分析甘油三酯的残渣，溶于1ml丙酮（4.1.4），转移到5ml玻璃管（5.7）。另一份残渣溶于1ml正庚烷（4.3.2）中，转移到另一5ml玻璃管（5.7）用于甲酯化。

6.2 HPLC分析甘油三酯

柱温20℃，流动相（4.2.1）脱气，流速0.6mL/min。基线稳定后进样。

5%纯化后油脂丙酮溶液，进样10μL，运行时间约60min，柱温及流速进行调节，使色谱图与图1类似，三亚油酸甘油酯出峰时间在15.5min，LLL/OLLn (峰1 and 2) 和 OLL/OOLn (峰4 and 5)峰组分辨率好。

最大峰峰2 (OLLn+PoLL)需至少达到总比例3%。

6.3 制备脂肪酸甲酯

0.1mL 2N KOH甲醇溶液（4.3.4）加入溶于1mL正庚烷（4.3.2）的纯化油脂中，盖紧盖子，剧烈摇晃15s，分层后至上层澄清（5min）。该溶液进行气相上机，室温最长保存时间12h。

6.4 脂肪酸甲酯的GC分析

初始箱温165℃，保持10min，1.5℃/min升至200℃。进样口温度220-250℃，检测器温度250℃。载气为氢气或氦气，压力130Kpa，SPL进样，进样量1μL。

图2为该气相色谱图，注意C18:3 和C20:1峰（C18:3必须先于C20:1），可对相应气相色谱条件进行优化。调整进样量及分流比分出棕榈酸及油酸。

C20:0峰高需占总比例20%，以期定量反式酸。如果C18:0出现变形，减少样品量。

7 色谱峰积分与结果计算

7.1 HPLC色谱图

图1为纯化后甘油三酯的图谱，峰型结合，三条基线需相同轨迹，第一条始于峰1终于峰3，第二个峰始于峰4，峰8后结束，第三条始于峰8后，结束于峰18。峰1至峰18各峰比例计算，相应峰占总峰面积百分比。

TAGx (%) = 100 (Ax / AT) 结果小数点后保留两位。

7.2 气相色谱图

图2为纯化后橄榄油的脂肪酸甲酯图谱。

各脂肪酸所占百分比：

棕榈酸P (C16:0) =甲酯+乙酯

硬脂酸S (C18:0) =甲酯

棕榈油酸 Po (C16:1) =两种顺式结构甲酯之和

油酸O (C18:1) =两种顺式结构甲酯、乙酯及反式之和

亚油酸 L (C18:2) =甲酯、乙酯、反式

亚麻酸 Ln (C18:3) =甲酯+反式异构体

二十碳酸A (C20:0) =甲酯

二十碳一烯酸 G (C20:1) =甲酯

脂肪酸乙酯及反式脂肪酸气相图谱中可能缺失。

C14:0 至 C24:0各比例除去角鲨烯相应百分比为：FAx (%) = 100 (Ax / AT)。

结果小数点后保留两位。

 

附录A

（规范性附录）

数学计算程序计算结果与真实橄榄油建立的数据库进行比较，鉴别初榨橄榄油中掺入其他植物油

A.1　计算

A.1.1　甘油三酯组成

ECN42 TAGs

LLL = 峰1

OLLn = 峰2+2a肩峰需算入

PLLn = 峰3

对一些油出峰条件好，肩峰能有效分开，这种情形需计入峰2

ECN44 TAGs

OLL = 峰4

OOLn = 峰5 + 后面的肩峰(图1 肩峰未出现)

PLL = 峰6

POLn = 峰7 +后面的肩峰(图1 肩峰未出现)

ECN46 TAGs

OOL = 峰8

A.1.2　脂肪酸组成

图2脂肪酸组成图谱P，Po，S，O，L，Ln，A和G必须计算出。

A.2　数学计算方法鉴别这些油

A.2.1　按组归类油脂参数

LLL_理论

△OOL=OOL_理论–OOL_HPLC

△LLL=LLL_HPLC–LLL_理论

Ln=%亚麻酸

△ECN44p=(PLL+POLn)_HPLC–(PLL+ POLn)_理论

油脂根据LLL_理论值划分为八组：

a) ≤0.010 %

b) ＞0.010 -≤0.022 %

c) ＞0.022 -≤0.040 %

d) ＞0.040 -≤0.070 %

e) ＞0.070 -≤0.110 %

f) ＞0.110 -≤0.170 %

g) ＞0.170 -≤0.250 %

h) ＞0.250 -≤0.350 %

j) ＞0.350 -≤0.550 %

k) ＞0.550

根据△OOL或△LLL的值每组油分成系列子集。

A.2.2　数据库比较参数

A.2.2.1　规定限制: △ECN42=ECN42_HPLC–ECN42_理论

结果需在规定限制范围内，这个限制范围在本标准中不去鉴定真伪。

A.2.2.2　对所有组的初始准则

K1 = (LLL_HPLC+OLLn_HPLC)×(OLL_理论+OOLn_理论)/(LLL_理论+OLLn_理论) ×(OLL_HPLC+OOLn_HPLC)

如果K1≤limit_lw，则油真实。

如果K1＞limit_up, 则油不真实。

A.2.2.3　第一准则：△R3=[OLL/OOLn]_HPLC–[OLL/OOLn]_理论

如果△R3≤limit_lw，则油真实。

如果△R3＞limit_up, 则油不真实。

A.2.2.4　第二准则：L3=[△LLL-△OLLn]/OLLn_理论

如果L3≤limit_lw, 则油真实。

如果L3＞limit_up, 则油不真实。

△OLLn=OLLn_实验–OLLn_理论

对于a组，第二准则是 R1_实验=LLL_HPLC/OLLn_HPLC

如果R1_实验≤limit_lw, 则油真实。

如果R1_实验＞limit_up, 则油不真实。

A.2.2.5　第三准则： R1_实验=LLL_HPLC/OLLn_HPLC

如果R1实验≤limit_lw, 则油真实。

如果R1实验＞limit_up, 则油不真实。

对于a组，第三准则是L3=[△LLL-△OLLn]/OLLn_理论

如果L3≤limit_lw, 则油真实。

如果L3＞limit_up, 则油不真实。

A.2.2.6　第四准则：△R1=[LLL/OLLn]_HPLC–[LLL/OLLn]_理论

如果△R1≤limit_lw, 则油真实。

如果△R1＞limit_up, 则油不真实。

对A、B、C组，△R1只有一个限制，△R1≤限制为真实，△R1＞限制为不真实。

A.2.2.7　第五准则：L4=[△LLL-△OLLn]/LLL_理论

如果L2≤limit_lw, 则油真实。

如果L2＞limit_up, 则油不真实。

A.2.2.8　R2 = [△OLL×LLL理论]/[△LLL×OLL理论]

△LLL=LLL_实验–LLL_理论和△OOL=OOL_实验–OOL_理论

如果R2≥limit, 则油真实。

如果R2＜limit, 则油不真实。

对E、F、G、H组，第六准则也包括△OOL，J组第六准则包括△OOL和△R3。

A.2.3　计算范围

每子集组，参数限制由下等式给出：

△ECN44p=(PLL+POLn)_实验–(PLL+POLn)_理论

第一、第二、第三、第四、第五准则有最大值和最小值(Limit_lw and Limit_up)，第六准则只有一个限制。a、b、c组具有第一、第二、第三准则，有最大值最小值，第四准则只有一个限制。

每条准则的值相继与最大值最小值进行比较，值介于最大值最小值，比较进行下去。图A.1为比较流程图。

A.3　计算机程序的应用

A.3.1　打开EXCEL。

A.3.2　打开25AVELL_computerprogram.xlsm。

A.3.3　激活“Macro”。

A.3.4　单击“Press to initiate calculation”按钮。

A.3.5　记录黄色值（图A.2）。

A.3.5.1　 “Sample code”输入样品描述。

A.3.5.2　“Oil category”栏。

“EV”食用初榨橄榄油 (特级，初榨)“L”橄榄果渣油；

“R”精炼橄榄油 (混合橄榄油或精炼橄榄油)

计算△ECN42范围需要这些值。

A.3.5.3　“Introd. FAMEs-GC”栏输入脂肪酸组成程序自动使各脂肪酸组成为百分含量。出现“Warning”，需修订脂肪酸值。

A.3.5.4　输入相应的甘油三酯数据。

A.3.6　根据修正后的脂肪酸组成计算理论甘油三酯组成。

A.3.7　采用实验和理论甘油三酯比例，计算出相应油的数学值和样本限值。

A.3.8　当红色区域出现命令“Press Ctrl+letter”，说明根据LLL_理论值分类，油处于letter（字母）所对应组。

A.3.9　同时按住“control（控制）”和指定的字母键，显示分析结果（图A.3）。

A.3.10　读取结果。

“The oil is correct”，表明是真实的橄榄油或掺假水平低。

“The oil is not correct”，表明不是真实的橄榄油。

A.3.11　点击“Press to print the results”打印结果。实验数据结果和限值两张表格会被打印。

A.3.12　点击“Press for a new calculation”初始化程序。所有的数据将被删除。

附录B

（规范性附录）

方法的选择性，特异性和可靠性

国际方法是基于掺杂物确定存在或不存在的一个数学算法，只能被视为一个二进制测试或定性的方法，因此，它根据统计算法的性能特点定性评价。定性研究方法的主要特性是选择性，特异性和可靠性。

选择性是指产生的结果是完全依赖于方法的测量。选择性量化为真值与真值性和假阴性值总和之间的比值。

特异性定义为无干扰的绝对选择。选择性量化为差异值与真值性和假阴性值总和之间的比值。

可靠性是以前的分析性能结果，其制定是对第一类和第二类错误概率的补充。前者的误差定义的比率为假阳性值与总掺伪样品的比值，后者是假阴性值与总真值样品的比值。

定性试验方法是基于二进制，3定量的参考水平为输出，即LOD，范围，和阈值。范围和阈值确定掺杂浓度，其中正确二元响应发生：没有，范围下；是，范围上。表B.1显示的值为所引用的范围，将一些列浓度梯度的榛子油加入橄榄油，实施一系列实验，估计阈值浓度的的相关概率（8%有94%的可能性）。阈值固定为10%，椭圆中94%主成分分析置信区间，不包括任何尖端10%。